[发明专利]一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用。本发明皮肤干细胞活性素是采用胎盘间充质干细胞经过接种培养、诱导分化以及皮肤干细胞活性素的制备与收集获得的。本发明的技术优势在于：采用胰蛋白酶与胶原蛋白酶复配使用用于酶解胎盘组织进而分散组织细胞；皮肤干细胞培养基采用基础培养基添加一系列功能性组分，有利于胎盘间充质干细胞的诱导分化成为皮肤干细胞以及后续皮肤干细胞的扩增培养；本发明制备的皮肤干细胞活性素应用于霜剂化妆品中能显著改善皮肤老化、降低不良反应的发生，增加角质层含水量和油脂含量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用。

背景技术

皮肤衰老是由于自然因素或非自然因素造成的皮肤老化现象，皮肤衰老与细胞衰老密切相关，尤其与成纤维细胞和角质形成细胞的衰老紧密联系。干细胞是一种尚未分化发育的细胞，具有无限自我更新复制能力，且能分化成特定组织，研究表明干细胞的自我复制及多潜能分化还依赖于多种生长因子、细胞因子、活性多肽、蛋白质、生长激素、微量元素等物质，促进自身的扩增及分化的子细胞的增殖。

中国专利CN103202794B公开了一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用，其中的一个主要发明点是将皮肤干细胞破碎，从细胞内容物中提取活性组分，但皮肤干细胞破碎后，会释放大量的酶，将皮肤干细胞分泌的生物活性成分降解，降低皮肤干细胞活性素的本质上的功效。

中国专利CN102552099B公开了一种用于皮肤美容修复的复合生物制剂及制备方法，该复核生物制剂含有脐带血干细胞活性成分和胎盘活性成分，具有促进产妇表皮干细胞的代谢，从而实现美容修复，护肤祛斑的目的，但所述的复合生物制剂是按照常规的护肤品生产方法制备而成的，即将脐带血干细胞活性物、胎盘活性物按比例与常规化妆品的赋形物混合按照常规的护肤品生产方法制成霜类化妆品等。众所周知，干细胞美容产品中的活性产品很容易在常温下失活，要保持它的活性，就必须在特定条件下制备和保存。因此此类干细胞美容产品的效果有待商榷。

发明内容

为解决现有技术中皮肤干细胞粉碎导致生物活性成分降解等问题，本发明提供一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用。

本发明一种皮肤干细胞活性素的制备方法，包括以下步骤：

S1、胎盘间充质干细胞的分离：取临床正常剖宫产的新鲜胎盘组织，无菌条件下分离胎盘中部内层组织剪成1cm×1cm×1cm的大小，用400-600u/ml的青霉素浸泡10-30min，用4℃D-Hank’s液冲洗3遍，用胰蛋白酶0.1-0.2g/mL和胶原蛋白酶0.05-0.08g/mL于37℃下消化30-60min，200目过滤网过滤收集组织细胞，红细胞裂解液4℃水浴3-5min去除红细胞即得；

S2、胎盘间充质干细胞的接种培养与诱导分化：将步骤S1得到的胎盘间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO₂、培养箱中孵育15-25h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近80-90％融合时，进行传代扩增培养；

S3、皮肤干细胞活性素的制备：将步骤S2中接种在皮肤干细胞培养基中的胎盘间充质干细胞扩增5-10代，收集培养上清液，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，合并滤液即得。

优选的，步骤S1所述的皮肤干细胞培养基包括以下组分及其浓度：基础培养基12-15mL、胰岛素15-25mg/L、L-谷氨酰胺2-8mg/L、表皮生长因子6-10μg/L、成纤维细胞生长因子1-3μg/L、神经生长因子0.85-0.9μg/L、糖皮质激素100-250μg/L、柠檬酸铁铵0.5-1.5mg/L、硝酸铁0.4-0.6mg/L、EDTA-2Na 4-8mg/L、虾青素4-6mg/L、黄芩甙元0.08-0.12mg/L、飞燕草素20-50μg/L和桑色素2-4ng/L。