[发明专利]一种生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法

说明书

本发明公开了一种生产无岩藻糖化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法。本发明通过利用CRISPR/Cas9技术敲除宿主细胞中的Slc35c1基因、和/或Fut8基因，获得Slc35c1基因沉默、和/或Fut8基因沉默的稳定基因工程细胞系。利用本发明的基因工程细胞系可以生产完全去除岩藻糖化的蛋白，并且传30代次后依然稳定，解决了现有技术中岩藻糖化去除不完全和传代不稳定的两大问题。通过本发明的方法生产出的无岩藻糖化的抗体表现出增强的ADCC活性从而增强了抗体临床治疗效果。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种可以生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法。

技术背景

自从1986年批准第一个抗体药物以来，抗体类药物已经过30多年的蓬勃发展，由于抗体药物具有高度的靶向性、特异性、专一性等明显优势，治疗领域也从传统的癌症、自身免疫性疾病逐步扩展到抗感染、代谢性疾病以及心血管疾病的诊治方面等，并取得了瞩目的疗效，在其改善患者生存质量的同时，也创造了巨大的经济效益。针对肿瘤的抗体除了阻断靶点介导的信号转导从而诱导细胞凋亡外，更多的治疗性抗体通过以下效应功能发挥治疗作用：细胞依赖的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)、细胞依赖的吞噬作用(antibody-dependent cellularphagocytosis，ADCP)、补体依赖的细胞毒性作用(complement-dependent cytotoxicity，CDC)等。

细胞依赖的细胞毒性作用(ADCC)是指表达抗体Fc受体(如FcγRIIIa)的自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞或中性粒细胞等，通过Fc受体与已结合在靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，进而活化，释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质直接杀伤靶细胞的作用。ADCC是治疗性抗体临床疗效的关键机制之一，对于抗体发挥疗效至关重要，这一点也得到了临床研究的支持。抗体与Fc受体(如FcγRIIIa)的结合情况直接影响抗体的ADCC效应功能，可以通过改变抗体Fc段的蛋白结构或是Fc段的寡糖链修饰以增强抗体与Fc受体(如FcγRIIIa)的结合能力，进而增强ADCC效应，增强抗体临床治疗效果。增强治疗性抗体的效应功能不仅能够获得更好的治疗效果，同时可以减少治疗所需抗体用量从而降低治疗成本。

近年来，研究发现去除或降低岩藻糖基化后，治疗性抗体在动物体内或临床表现出更好的疗效。主要是由于去除或降低岩藻糖基化的抗体提高与FcγRIIIa亲和力，可以在更低浓度下通过与FcγRIIIa的高亲和力而表现出较强的ADCC作用，去除或降低岩藻糖基化成为提高下一代治疗性抗体效能的有效方法之一。因此，研究出能生产无岩藻糖基化抗体的工程细胞株是本领域的技术人员急待解决的问题。

但目前大多数单克隆抗体都是由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞制备的，这类抗体的核心岩藻糖基化水平很高，如何去除抗体Fc区的核心岩藻糖提高其ADCC效应是目前此类抗体研究的主要热点之一。其中，于2013年被批准上市的Gazyva(Obinutuzumab)，是获批上市的糖工程化单克隆抗体，其岩藻糖敲除是基于罗氏的GlycoMab^TM技术平台，通过高表达β-1,4-N乙酰葡萄糖胺基-转移酶III(GnTIII酶)，促进N-糖末端平分型半乳糖苷的加入，进而抑制抗体核心岩藻糖修饰，进一步增强了抗体的ADCC活性。但是该糖基化改造技术存在一定的缺陷：该技术通过引入平分型半乳糖苷，使得抗体上的糖型多达30种以上，其种类更多、更为复杂化，增加了糖型的异质性和产品的质量控制难度；此外该方法的岩藻糖去除效率低，仍有约30％的糖型含有核心岩藻糖。

本申请通过对Slc35c1和Fut8两个基因同时敲除能够完全去除蛋白的岩藻糖基化，并且传30代次后仍无法检测到岩藻糖基化的蛋白，解决了岩藻糖基化去除不完全和传代不稳定的两大问题。

发明内容