[发明专利]单管巢式PCR反应体系和扩增方法

说明书

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，提供了一种单管巢式PCR反应体系，其包括双链DNA模板、外引物对和内引物对，所述外引物从5’端到3’端包括互补序列和靶区结合序列，所述靶区结合序列远离互补序列的末端与所述互补序列的碱基互补，所述外引物用于在第一退火温度下对变性解链的DNA模板扩增并获得中间产物，所述内引物用于在第二退火温度下对变性解链的中间产物扩增并获得目标产物，所述外引物在第二退火温度下形成引物双链结构。本发明还提供一种单管巢式PCR扩增方法，本发明的单管巢式PCR反应体系和扩增方法，保证了单管扩增后目标产物的纯度较高。

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种单管巢式PCR扩增方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR) 是用于扩增DNA 链的特定区域的技术。DNA 链可以是单个基因、基因的仅仅一部分或非编码序列。大部分PCR 方法通常扩增多达10k 碱基对(kilobase pair，kb) 的DNA 片段，但一些技术允许扩增大小达40kb 的片段(Cheng 等，1994，Proc Natl Acad Sci.91 ：5695-5699)。

现有技术为提高PCR扩增特异性提供了一种巢式PCR扩增方法。巢式PCR扩增反应在两个接连的反应中使用两组不同引物。在一扩反应中，使用第一引物对靶标区域DNA片段进行一阶段PCR扩增产生中间产物，该中间产物可能还含有从非靶标区域扩增的产物。然后将中间产物用于起始二扩反应，所述二扩反应使用第二引物对靶标区域DNA片段进行二阶段PCR扩增产生目标产物。通常，第二引物对的结合位点位于第一引物对以内。巢式PCR通常在一个试管中进行一扩反应，然后将中间产物的等分试样转移到第二试管中进行二扩反应。现有技术巢式PCR扩增方法的中间产物在两个试管之间移转会增加扩增产物对环境的污染，甚至导致后续试验结果出现严重偏差。因此，急需一种单管巢式PCR扩增方法，用于消除现有技术巢式PCR扩增方法的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单管巢式PCR扩增方法，用于克服双管巢式PCR扩增方法的技术问题。

一种单管巢式PCR反应体系，其包括双链DNA模板、外引物对和内引物对，所述外引物从5’端到3’端包括互补序列和靶区结合序列，所述靶区结合序列远离互补序列的末端与所述互补序列的碱基互补，所述外引物用于在第一退火温度下对变性解链的DNA模板扩增并获得中间产物，所述内引物用于在第二退火温度下对变性解链的中间产物扩增并获得目标产物，所述外引物在第二退火温度下形成引物双链结构。

进一步的，所述引物双链结构包括引物发卡结构或引物二聚体结构。

进一步的，所述外引物对包括第一外引物和第二外引物，所述引物双链结构为第一外引物和第二外引物之间形成的双链结构。

进一步的，所述外引物对包括第一外引物和第二外引物，所述引物发卡结构包括第一外引物或第二外引物自身形成的双链结构。

进一步的，所述第一退火温度的范围可以是65-72℃，所述第二退火温度的范围是50-62℃。

进一步的，所述第一退火温度为65度，所述第二退火温度为52度。

一种单管巢式PCR扩增方法，其包括：

建立反应体系，所述反应体系中包括双链DNA模板、外引物对和内引物对，所述外引物从5’端到3’端包括互补序列和靶区结合序列，所述靶区结合序列远离互补序列的末端与所述互补序列的碱基互补；

进行一扩反应，在第一退火温度下通过外引物对实现对变性解链的DNA模板扩增并获得中间产物；

进行二扩反应，在第二退火温度下通过内引物对中间产物扩增并获得目标产物，所述外引物在第二退火温度形成引物双链结构。

进一步的，所述引物双链结构包括引物发卡结构或引物二聚体结构。