[发明专利]一种猪伪狂犬病毒的分离方法

说明书

一种猪伪狂犬病毒的分离方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括以下步骤：1）病料的处理；2）动物接种；3）细胞接种；4）病毒鉴定。本发明具有以下有益效果：本发明所提出的一种猪伪狂犬病毒的分离方法，病料采集范围广且方便，可以实现对隐形感染活体猪的病毒分离；可以获的高纯化水平、病毒含量均高的病毒；大大缩短了病毒分离时间，利于猪伪狂犬病及时诊断和研究。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病毒的分离方法。

背景技术

猪伪狂犬病（Pseudorabies , PR）是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种高度接触性传染病，猪既是伪狂犬病毒的贮存者，也是伪狂犬病毒的传染源，该病在临床上主要以发热、奇痒及脑脊髓炎为特征，可引起妊娠母猪繁殖障碍、流产、死胎、呼吸症状；成年猪感染后耐过，呈隐性感染，但长期带毒排毒；新生仔猪除出现神经症状外，还可侵害消化系统，成为最危险的传染源，严重影响种猪场生产，本病广泛分布于世界各地，给养猪业构成很大威胁。

猪伪狂犬病毒的分离对于猪伪狂犬病的控制具有重要作用，但传统的病毒分离，仅限于采取病死猪且具有明显病变的脑、肺、脾、淋巴结等组织病料，对于呈隐性感染的成年猪，不表现临床症状，应用传统的分离方法将无法分离到病毒，极大的限制了对该病的及时诊断；应用传统分离方法分离的病毒含量一般较低，分离操作时间较长。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种猪伪狂犬病毒分离方法的技术方案，该方法能够从隐性感染猪的唾液或粪便中分离到病毒，为猪伪狂犬病的诊断及研究提供依据。

所述的一种猪伪狂犬病毒的分离方法，其特征在于包括以下步骤：

1）用棉拭子蘸取隐性感染猪的唾液或粪便，置于PH为6.5-7.5的经4℃遇冷的1-3ml的病毒溶解液中，混合均匀，置于4℃静止3-5min，使唾液或粪便中的病毒完全溶于溶解液中，经离心、滤膜过滤后得到病样处理液，置于-20℃保存；

2）将病样处理液按0.2ml/只经腹腔注射接种于8周龄Balb/c小鼠中，观察至48-72h，无菌取病死鼠的脑、肺、脾等组织0.3-0.6 g，用均浆机研碎至均匀的组织液，按1:1-1:3添加经4℃遇冷的病毒溶解液，混合均匀，置于4℃静止3-5min，经离心、滤膜过滤后得到小鼠病料滤液，置于-20℃保存；

3）取1ml小鼠病料滤液接种于已铺满70-80% ST细胞的T25细胞瓶中，置于CO₂培养箱中培养，待70-80%细胞呈拉网状病变，进行收毒，按1:1-1:3添加经4℃遇冷的病毒溶解液，混合均匀，置于4℃静止3-5min，置于-20℃保存，即得到PRV细胞病毒液。

所述的一种猪伪狂犬病毒的分离方法，其特征在于所述的病毒溶解液每1000ml由以下成分组成：氯化钠1-5 g、六水氯化镁0.5-3g 、碳酸氢钠0.1-1 g、苦参碱2-6 mg、海藻糖1-5 mg、三磷酸腺苷二钠0.8-3 g、二水磷酸二氢钠0.1-1 g、氯化钾0.05-0.5 g；将以上各成分充分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经0.22um滤膜进行过滤即得。

所述的一种猪伪狂犬病毒的分离方法，其特征在于所述的步骤1）和2）中离心、滤膜具体为：3000-5000 r/min离心5-10min，取上清液，依次再通过0.45um、0.22um的滤膜进行过滤。

所述的一种猪伪狂犬病毒的分离方法，其特征在于所述的步骤3）中CO₂培养箱条件为37℃、5%的CO₂培养箱培养72-96h。