[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离方法

说明书

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离方法属于兽用生物制品技术领域。其包括以下步骤：1）PAM原代细胞的制备；2）病料的采集与处理；3）病毒的细胞接种；4）病毒鉴定。本发明具有以下有益效果：本发明所提出的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离方法，病料的处理方法无需冻融，机械化程度高，省时省力；提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒培养的易感原代细胞，PAM原代细胞制备简单快速，成本低廉，还大大缩短了病毒的分离周期，有利于猪繁殖与呼吸综合征病毒病的及时诊断和研究。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus, PRRSV)所引起猪的一种高度接触性传染病，其主要症状是引起妊娠母猪早期流产、死胎、木乃伊胎及产弱仔等繁殖障碍以及各年龄猪发生呼吸道症状、仔猪高死亡率等同时PRRSV可引起动物机体发生免疫抑制，进而继发多种病原的感染。目前，PRRS在全世界几乎所有养猪地区都已流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，引起了国内外的广泛关注。

为了更好的控制PRRS，很多学者已从预防、诊断、防控等多个方面开展研究。PRRSV是一种单股、正链不分节段的RNA病毒，其在生物分类学上隶属于尼多病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，PRRSV基因组全长在14.9-15.5kb不等，包括结构蛋白和非结构蛋白，在非结构蛋白中，ORF1b基因具有独特的三磷酸核苷结合位点，而许多中药含有丰富的核苷成分，病毒可以与中药中的核苷成分很好的结合。鉴于此，我们提出了将中药用于PRRSV的分离提取中。

传统的PRRSV病毒分离方法周期较长，病毒样品处理过程较为繁琐，而且易污染，分离的病毒纯度还不高，还不利于PRRS的及时诊断，因此，发明一种PRRS的快速分离鉴定方法，对于该病的迅速诊断及研究具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒快速分离鉴定方法的技术方案，该方法为猪繁殖与呼吸综合征的诊断及研究提供依据。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离方法，其特征在于包括以下步骤：

取完整新鲜的仔猪肺脏，采用肺泡灌洗法分离PAM，用漏斗将100-200 mL无菌、4℃预冷的PBS溶液从气管灌入肺脏内，按摩肺叶后倒出支气管肺泡灌洗液BALF，重复上述冲洗过程3-5次，将每次得到的BALF混合在一起，用3层无菌纱布过滤，再置于4℃下1000 r /min 离心10min收集细胞，用PBS洗涤2次；加入含有10% 新生牛血清的RPMI -1640或DMEM培养液，所述的RPMI -1640和DMEM培养液中含L-glutamine悬浮细胞，并进行细胞计数，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中分别培养0.5、1、2、6、24 h后，更换新培养液，最后剩余细胞均为贴壁细胞；

2）从临床疑似的PRRS患病仔猪采集肺、淋巴结，放置于经4℃遇冷的8-20 ml的生理盐水中，温度控制在25℃以下，用高压匀质机进行匀浆处理，即得到匀浆处理液，再向匀质处理液中加入生理盐水体积总量的1-5倍的病毒处理溶液，混合均匀，静置5-15min，按3000-5000 r/min，8-15 min进行离心，取上清，经过0.22um的微孔滤膜进行过滤，即得PRRSV病毒原液；

3）在步骤1）中已培养24h贴壁生长良好的原代PAM细胞，弃去细胞培养液，将PRRSV病毒原液与细胞培养液按体积比1:5-1:10加入，将细胞瓶置于37℃， 5%CO₂培养箱中孵育0.5-1h，弃掉病毒液，加入含2%胎牛血清的病毒维持液，继续培养96-120 h，每天观察细胞病变，收集病变明显的细胞液，置于-20℃保存。