[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离方法

权利要求书

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离方法，其特征在于由以下步骤组成：

取完整新鲜的仔猪肺脏，采用肺泡灌洗法分离PAM，用漏斗将100-200 mL无菌、4 ℃预冷的PBS溶液从气管灌入肺脏内，按摩肺叶后倒出支气管肺泡灌洗液BALF，重复上述冲洗过程3-5次，将每次得到的BALF混合在一起，用3层无菌纱布过滤，再置于4℃下1000 r /min离心10min收集细胞，用PBS洗涤2次；加入含有10% 新生牛血清的RPMI -1640或DMEM培养液，所述的RPMI -1640和DMEM培养液中含L-glutamine悬浮细胞，并进行细胞计数，置于37℃、5% CO2的培养箱中分别培养0.5、1、2、6、24 h后，更换新培养液，最后剩余细胞均为贴壁细胞；

2）从临床疑似的PRRS患病仔猪采集肺、淋巴结，放置于经4℃遇冷的8-20 ml的生理盐水中，温度控制在25℃以下，用高压匀质机进行匀浆处理，即得到匀浆处理液，再向匀质处理液中加入生理盐水体积总量的1-5倍的病毒处理溶液，混合均匀，静置5-15min，按3000-5000 r/min，8-15 min进行离心，取上清，经过0.22um的微孔滤膜进行过滤，即得PRRSV病毒原液；

每1000ml病毒处理溶液由以下成分组成：菟丝子提取物1-5 mg、五味子提取物0.1-2mg、桑葚多糖1-3 mg、覆盆子酸0.1-0.5 mg、柠檬酸钠1-3 g、氯化钠5-10 g、氯化钾0.01-0.05 g；将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用；

3）在步骤1）中已培养24h贴壁生长良好的原代PAM细胞，弃去细胞培养液，将PRRSV病毒原液与细胞培养液按体积比1:5-1:10加入，将细胞瓶置于37℃， 5%CO₂培养箱中孵育0.5-1h，弃掉病毒液，加入含2%胎牛血清的病毒维持液，继续培养96-120 h，每天观察细胞病变，收集病变明显的细胞液，置于-20℃保存。

2.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离方法，其特征在于所述的步骤1）中每1000 mlPBS溶液由以下成分组成：氯化钠6-10 g、氯化钾0.05-0.5 g、磷酸氢二钠1-1.2 g、磷酸二氢钾0.1-1g、氯化钙0.05-0.2 g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2 g、青霉素60-100 mg、链霉素60-100 mg；将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，用0.5mol/L的盐酸溶液调至PH值6.0-6.8，再经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。