[发明专利]一种表达L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌

说明书

本发明公开了一种表达L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过人工合成SPase基因、设计引物、PCR获得Leuconostoc mesenteroides来源蔗糖磷酸化酶目的基因，构建重组质粒pBSMuL3‑SP，并转化至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(CCTCC M2016536)，得到重组枯草芽孢杆菌。以此枯草芽孢杆菌为菌种，发酵生产SPase。将重组蔗糖磷酸化酶应用于制备α‑熊果苷具有比较好的效果。本发明以食品安全的枯草芽孢杆菌为表达宿主重组表达蔗糖磷酸化酶，产酶水平高，便于分离纯化，且发酵原料来源广泛，生产成本较低。

技术领域

本发明涉及一种表达L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，Sucrose Phosphorylase,SPase)，是GH13家族中的一员，是催化转移葡萄糖苷键的特异性酶。主要催化2种类型的反应：一是将1-磷酸葡萄糖中的葡萄糖基转移至受体；二是将蔗糖中的葡萄糖基转移至受体，受体包括无机磷酸、水、含酚羟基、醇羟基及羧基的物质。当以酚羟基作为受体时转化产物为α-熊果苷。α-熊果苷作为一种国际上正在极力推广的高功效医药、化妆品添加剂，在国内外有巨大的需求，在化妆品美白祛斑领域占据重要的地位。据调研α-熊果苷的市场价值约每公斤3800元，而其原料对苯二酚的市场价值约66元每公斤，所以α-熊果苷是一种高附加值的产物，如果能够实现产业化生产将会带来非常大的经济收益。蔗糖磷酸化酶还可催化合成某些不稳定物质的衍生物，提高其稳定性。因此，蔗糖磷酸化酶在食品、化妆品及医药方面有广泛的应用价值。

蔗糖磷酸化酶属胞内酶，酶的基因主要来源于肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)、长双歧杆菌(Bidifobacterium longum)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)。目前L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶只在大肠杆菌中获得异源表达，但是大肠杆菌容易产生内毒素，不适合应用于医药、化妆品等行业。

发明内容

为解决上述问题，本发明首次以适于食品使用的枯草芽孢杆菌为宿主菌构建了重组表达L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶菌株，电泳结果显示蔗糖磷酸化酶获得了高水平表达，为α-熊果苷的工业化制备奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种重组表达L.mesenteroides来源蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以保藏编号为CCTCC M2016536的枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pBSMuL3。

本发明的第二个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因与表达载体连接，转入枯草芽孢杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。