[发明专利]一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法

说明书

本发明公开一种一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法。该方法利用RT‑ddPCR，结合用于RT‑qPCR检测GII型诺如病毒的引物和探针，进行反应，实现GII型诺如病毒的高灵敏快速检测。本方法灵敏度高，可达约2copies/μL，而常规的RT‑qPCR的灵敏度通常为10copies/μL左右；扩增效率高，扩增效率为95.4％，R²＝0.9973。在低拷贝数下比RT‑qPCR更能有效规避果蔬中抑制物的影响，减少了假阴性的产生。因此，本发明检测方法灵敏、准确、直观，对农业部、检验检疫局等政府部门以及相关检测机构和企业提供了新的检测方法并具有指导意义。

技术领域

本发明涉及食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法。

背景技术

食源性病毒疾病是一个正在受到关注的社会问题。在世界范围内，50％以上的急性肠胃炎事件是由诺如病毒所造成，其中主要的基因型为GII。诺如病毒最早在1972年被Kapikan等人所检出。它具有感染剂量低，能忍受大范围温度变化等特点，是造成非细菌性急性肠胃炎的重要原因。它主要传播途径为“粪--口”传播，可通过人与人之间直接传播，或接触到被污染的水和食物而进行传播，常受到污染的食品有蔬菜，软质水果，贝类等。如何检测食品中的诺如病毒并进行定量，是一个热点问题。目前诺如病毒的检测方法通常采用荧光定量qPCR进行定性和定量分析。2017年国家颁布食品中诺如病毒检测的荧光定量PCR方法--《GB 4789.42-2016食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》。然而在qPCR方法的实际检测应用中发现：若检测样品存在PCR抑制物，则会降低其灵敏度和准确性，易造成假阴性；同时RT-qPCR法需要依赖Ct值和标准曲线的准确性才能对样品进行定量分析，存在一定的不确定性，难以检测微小的拷贝数变化；灵敏度有限也是qPCR的一个不足之处。鉴于诺如病毒是一种高感染性病毒，在食品中的病毒量通常偏低，因此如何提高检测灵敏度，建立可信的检测方法，科学评估受感染食品的安全风险是一个急需解决的问题。

微滴数字PCR(ddPCR)是一种与qPCR不同的定量技术，ddPCR中单个核酸分子被分配到体积极小(0.5fL～0.5nL)的油包水微滴中，使大部分微滴中的核酸分子数目为1或0，这允许在1μL的乳化剂中形成大约10⁷个反应，然后通过PCR扩增和荧光信号的累计读取阳性微滴数目，再根据泊松分布计算出样本中的核酸分子数。ddPCR对检测目标的定量无需标准曲线，就可以实现核酸绝对定量分析。相比现有的常规和实时定量PCR，ddPCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力极大地提高，微滴离散技术同时可以规避样品PCR抑制物的影响，从而提高了检测灵敏度。ddPCR现在比较多用于转基因食品中检测，但用于食源性病毒上并未见到有应用，因此若能将ddPCR应用到食源性病毒的检测之中，将有效扩大病毒检测方法的范围，并能有效提高检测隐藏于食品抑制物中的病毒。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法，包括如下步骤：

(1)对果蔬样品中病毒进行洗脱，得到洗脱悬浮液，然后加入氯仿/正丁醇溶液，混合，室温静置，离心，收集上层水相；

(2)以步骤(1)得到的上层水相进行病毒RNA提取，得到病毒RNA样品；

(3)利用逆转录微滴数字聚合酶链式反应(RT-ddPCR)，结合已报道用于实时荧光定量RT-qPCR检测GII型诺如病毒的引物和探针，进行扩增反应，建立一步法RT-ddPCR高灵敏快速检测GII型诺如病毒的方法，实现GII型诺如病毒的高灵敏快速检测。

所述的果蔬样品的水果为软质水果。