[发明专利]一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法

权利要求书

1.一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)对果蔬样品中病毒进行洗脱，得到洗脱悬浮液，然后加入氯仿/正丁醇溶液，混合，室温静置，离心，收集上层水相；所述的果蔬样品的水果为软质水果；所述的洗脱悬浮液与氯仿/正丁醇溶液的体积比为1:1；

(2)以步骤(1)得到的上层水相进行病毒RNA提取，得到病毒RNA样品；

(3)利用RT-ddPCR，结合用于实时荧光定量RT-qPCR检测GII型诺如病毒的引物和探针，进行扩增反应，建立一步法RT-ddPCR高灵敏快速检测GII型诺如病毒的方法；

步骤(3)中所述的引物和探针：

上游引物QNIF2：5′-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3′；

下游引物COG2R：5′-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3′；

探针QNIFs：5′-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-BHQ1-3′；

步骤(3)中所述的RT-ddPCR的反应体系为：

所述的RT-ddPCR的反应条件为：

逆转录42℃60min，95℃10min灭活逆转录酶，95℃30s，54℃±2℃1min，45个循环，98℃10min，爬坡速度为1℃/s。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述的对果蔬样品中病毒进行洗脱的方法，包括如下步骤：

1)将果蔬样品切成2.5cm*2.5cm*2.5cm的小块，装入锥形瓶中，加入TGBE溶液，对于水果还要额外加入1140U A.aculeatus果胶酶，用锡纸盖好瓶口；

2)室温250r/min，振荡20min±1min，若pH低于9.0则需要用1mol/L的NaOH调节至pH＝9.5±0.1；

3)将振荡液转移至离心管，8698～10000r/min，4±1℃离心30min±5min；取上清，用1mol/L的HCl调pH至7.0±0.5；

4)加入1/3体积的4X PEG8000/NaCl溶液，使终浓度为100g/L PEG8000，0.3mol/LNaCl；60s摇匀，在4±1℃，200r/min频率下振荡60±5min；

5)在4±1℃，8698～10000r/min离心30min±5min；弃上清，再在4±1℃，8698～10000r/min离心5±1min，紧实沉淀，弃上清；

6)加入PBS进行悬浮沉淀，得到洗脱悬浮液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的氯仿/正丁醇溶液中氯仿与正丁醇的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的室温静置的时间为5±1min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的离心的条件为4±1℃、8698～10000r/min离心15min±1min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的RT-ddPCR的反应体系为：