[发明专利]柑橘类病毒cDNA二聚体及其侵染性克隆的快速制备新方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种柑橘类病毒cDNA二聚体及其侵染性克隆的快速制备新方法。

背景技术

类病毒是一类246～401-nt大小的闭合环状的单链小分子RNA，能在敏感寄主上引发严重病症，是一种重要的植物病原物。柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)属于马铃薯块茎类病毒科(Pospiviroidae)马铃薯块茎类病毒属(Pospiviroid)，是柑橘裂皮病的病原，可在枳和枳橙砧木上引起严重的裂皮症状，是威胁世界柑橘产业发展的重要病害之一。柑橘树皮裂纹类病毒(Citrus bark cracking viroid,CBCVd)属于马铃薯块茎类病毒科(Pospiviroidae)椰子死亡类病毒属(Cocadviroid)，可在无CEVd的情况下与其他柑橘类病毒复合侵染枳橙砧木引起类似柑橘裂皮病的症状。由CBCVd引起的啤酒花矮缩病是啤酒花上一种毁灭性病害，症状包括叶片卷曲，黄化，过早开花和球果尺寸变小，干根腐烂，植株发育迟缓甚至死亡。

另外，前人研究表明，CEVd和CBCVd在某些敏感寄主上存在交叉保护现象，然研究者对其互作机理尚不清楚。两种类病毒复合侵染能明显降低CEVd在敏感砧木上的症状，这为预防柑橘裂皮病提供了交叉保护的新思路。最近研究表明，来源于类病毒的小RNA在类病毒致病性上扮演了重要角色。前期研究表明，由CEVd和CBCVd负链产生的小RNA主要来自于两者基因组具有高度序列同源性的区域，分析交叉保护现象与这些小RNA可能有紧密联系。

方便快捷的植物病原物侵染性克隆构建方法，是研究病原致病性的基础和保证，可用于植物和病原之间的互作，外源基因的表达以及由其引起的基因沉默研究等。类病毒侵染性克隆的构建方法可广泛应用在其侵染性研究，症状分析，致病性研究，以及类病毒在寄主中的移动途径研究等。

传统的类病毒构建方法操作步骤繁琐，耗时费力，且所用载体和试剂复杂多样，成本较高。以下是常见的类病毒侵染性克隆构建方法：选择合适的酶切位点设计引物扩增类病毒全长目标片段，克隆测序后筛选优势序列用于构建侵染性克隆，通常选用pGEM-T载体，类病毒单体质粒构建完成后进行酶切并回收目的片段和载体(目的片段用于连接成二聚体，回收载体经脱磷后与二聚体进行连接)。将回收的单体片段加入连接酶后进行连接，得到含有类病毒全长二聚体的连接混合液，向此混合液中加入回收并且脱磷的载体，再一次进行连接处理。之后转化连接产物，涂板培养后挑选单克隆进行酶切或者菌液PCR鉴定，最后通过测序鉴定是否得到正确的二聚体重组质粒。根据插入片段的方向，选择合适的酶进行单酶切，使用RNA聚合酶体外转录目标片段获得具有侵染活性的类病毒二聚体RNA。

发明内容

本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种柑橘类病毒cDNA二聚体及其侵染性克隆的快速制备新方法。

本发明实现其目的的技术方案为：

一种柑橘类病毒cDNA二聚体的快速制备新方法，包括如下步骤：

(1)提取柑橘类病毒的总RNA；

(2)利用一步法RT-PCR对提取的总RNA进行扩增，PCR反应体系包括：PrimeScript 1step Enzyme Mix、MgCl₂、类病毒全长扩增引物、总RNA、无RNA酶的水；扩增完毕即得柑橘类病毒cDNA二聚体。

在上述技术方案中，所述的柑橘类病毒为CEVd，使用的类病毒全长扩增引物对为：CEVd-For/CEVd-Rev，引物序列为CEVd-For：5'-ggaaacctggaggaagtcgag-3'，CEVd-Rev：5'-ccggggatccctgaaggactt-3'。

在上述技术方案中，所述的PCR反应体系总体积为25ul，由如下组分组成：2×one-step Buffer 12.5ul、25mM的MgCl₂ 3～5ul、10uM的CEVd-For 0.4～0.6ul、10uM的CEVd-Rev 0.4～0.6ul、PrimeScript 1step Enzyme Mix 0.2～1ul、总RNA100～1000ng，余量为无RNA酶的水。

在上述技术方案中，PCR反应条件为：50℃反转录30min；95℃酶灭活3min；然后95℃/30s，58℃/30s，68℃/1min，35个循环；最后68℃延伸10min。