[发明专利]柑橘类病毒cDNA二聚体及其侵染性克隆的快速制备新方法

权利要求书

1.一种柑橘类病毒cDNA二聚体的快速制备新方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取柑橘类病毒的总RNA；

(2)利用一步法RT-PCR对提取的总RNA进行扩增，PCR反应体系包括：PrimeScript 1step Enzyme Mix、MgCl₂、类病毒全长扩增引物、总RNA、无RNA酶的水；扩增完毕即得柑橘类病毒cDNA二聚体。

2.如权利要求1所述的柑橘类病毒cDNA二聚体的快速制备新方法，其特征在于，所述的柑橘类病毒为CEVd，使用的类病毒全长扩增引物对为：CEVd-For/CEVd-Rev，引物序列为CEVd-For：5'-ggaaacctggaggaagtcgag-3'，CEVd-Rev：5'-ccggggatccctgaaggactt-3'。

3.如权利要求2所述的柑橘类病毒cDNA二聚体的快速制备新方法，其特征在于，所述的PCR反应体系总体积为25ul，由如下组分组成：2×one-step Buffer 12.5ul、25mM的MgCl₂3～5ul、10uM的CEVd-For 0.4～0.6ul、10uM的CEVd-Rev 0.4～0.6ul、PrimeScript 1 step Enzyme Mix 0.2～1ul、总RNA 100～1000ng，余量为无RNA酶的水。

4.如权利要求3所述的柑橘类病毒cDNA二聚体的快速制备新方法，其特征在于，PCR反应条件为：50℃反转录30min；95℃酶灭活3min；然后95℃/30s，58℃/30s，68℃/1min，35个循环；最后68℃延伸10min。

5.如权利要求1所述的柑橘类病毒cDNA二聚体的快速制备新方法，其特征在于，所述的柑橘类病毒为CBCVd，使用的类病毒全长扩增引物对为：CBCVd-For/CBCVd-Rev，引物序列为CBCVd-For：5'-ggggaaatctcttcagac-3'，CBCVd-Rev：5'-ggggatccctcttcaggt-3'。

6.如权利要求5所述的柑橘类病毒cDNA二聚体的快速制备新方法，其特征在于，在利用总RNA进行一步法RT-PCR扩增之前，先将总RNA进行高温解链处理。

7.如权利要求5所述的柑橘类病毒cDNA二聚体的快速制备新方法，其特征在于，所述的PCR反应体系总体积为25ul，由如下组分组成：2×one-step Buffer 12.5ul、25mM的MgCl₂3～5ul、10uM的CBCVd-For 0.4～0.6ul、10uM的CBCVd-Rev 0.4～0.6ul、PrimeScript 1 step Enzyme Mix 0.5ul、总RNA 100～1000ng，余量为无RNA酶的水。

8.如权利要求7所述的柑橘类病毒cDNA二聚体的快速制备新方法，其特征在于，PCR反应条件为：55℃反转录30min；94℃酶灭活3min；然后94℃/30s，58℃/30s，68℃/45min，35个循环；最后68℃延伸7min。

9.一种柑橘类病毒侵染性克隆的快速制备新方法，其特征在于，先利用权利要求1至8任一项所述的方法制备得到柑橘类病毒cDNA二聚体，然后将该二聚体克隆进T载体，获得包含该二聚体的连接产物，即得此柑橘类病毒的侵染性克隆。

10.如权利要求9所述的柑橘类病毒侵染性克隆的快速制备新方法，其特征在于，所述的T载体为pGEM-T easy载体。