[发明专利]利用转录组测序的SSR分子标记鉴定火龙果种质的方法

说明书

本发明公开了一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定火龙果种质的方法，该方法设计序列表所示的EST‑SSR标记引物并包括以下步骤：S1，取火龙果幼嫩茎尖，用于提取基因组DNA；S2，基于火龙果转录组测序的序列设计SSR引物，并进行PCR扩增体系优化；S3，PCR采用10μl反应体系：包含10‑50ng模板DNA 1‑2μl，正、反向引物各0.2‑0.5μl，5μl Mix及适量ddH₂O；S4，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃反应30s，54‑63℃反应30s，72℃反应30s，进行35个循环；72℃延伸8min；4℃最终保存；S5，PCR扩增产物先进行引物初步筛选，然后再进行多态性筛选，根据谱带的有无和大小来判定结果。本发明需要解决的关键技术是EST‑SSR标记引物的获得和筛选，以及PCR扩增体系的优化。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及基于火龙果转录组测序序列而开发的SSR引物、PCR扩增及其应用。基于转录组序列开发的多对SSR标记引物，专用于从DNA水平对火龙果种质的快速鉴定及亲缘关系分析。

背景技术

火龙果(Hylocereusspp.)属于仙人掌科(Cactaceae)量天尺属(Hylocereus)和蛇鞭柱属(Seleniereus)，是近年来被广泛关注的一种新兴热带、亚热带水果。火龙果适宜种植范围广、抗病虫害能力强、产量高、效益好和市场风险小，因此火龙果种植被视为一个有良好市场前景和经济效益的农业开发项目。火龙果种质的准确、高效鉴定和亲缘关系分析，对种质的知识产权保护、开发和利用具有重要现实意义。

目前，火龙果遗传背景并不清晰，这给火龙果种质鉴定、杂交育种、新种质挖掘等带来了很大困难，随着分子生物学技术的发展，RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等分子标记技术已被用于火龙果种质鉴定、亲缘关系分析和遗传图谱构建，但这些多为显性标记，不能区分纯合体和杂合体，且这些分子标记覆盖火龙果基因组比例较小，标记密度较低。

SSR分子标记广泛应用于评价种质资源、分析遗传多态性和构建遗传图谱研究，具有共显性、多态性丰富、重复性和稳定性好等优点，EST-SSR分子标记基于基因编码区开发，可直接反映基因的表达信息，并具有较高的保守性和通用性。

发明内容

为了克服火龙果现有分子标记多为显性标记，不能区分纯合体和杂合体，且覆盖火龙果基因组比例较小，标记密度较低等缺点，本发明旨在提供多态性检出率高、分辨率更好、共显性、稳定可靠、简单高效的分子标记鉴定方法。该方法可直接用于火龙果种质鉴定、亲缘关系分析和遗传图谱构建，为种质知识产权保护和遗传改良提供更好的分析工具。本发明需要解决的关键技术是EST-SSR标记引物的获得，以及PCR扩增体系的优化。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明的EST-SSR标记引物为如下表的1对或任意几对：

本发明的方法包括如下步骤：

1.取新采集的或-80℃下保存的幼嫩茎尖，利用天根DNAsecure Plant Kit试剂盒提取基因组DNA；

2.根据火龙果转录组测序的序列，设计合成125对EST-SSR引物，并进行PCR扩增体系优化：

1)PCR反应体系为(10μl体系)：10-50ng的模板DNA 2μl，正、反向引物(10μM)0.25μl，5μl Mix及适量ddH₂O(2.5μl)。其中，Mix含0.1U/μl Taq polymerase，500μM dNTP，20mMTris-HCl(pH8.3)，100mM KCl，3mM MgCl₂，以及其它稳定剂和增强剂，这里的其它稳定剂和增强剂采用现有的常规技术的稳定剂和增强剂即可。

PCR反应程序为：