[发明专利]RSV-PCV联合疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种RSV-PCV联合疫苗，其特征在于，所述疫苗以肺炎链球菌多糖-蛋白载体-RSV特异性蛋白为抗原，其中：该多糖为13价肺炎链球菌荚膜多糖，所述肺炎球菌的血清型为1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；蛋白载体为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白和霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白(CTB)的融合蛋白，重组蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：10所示；肺炎链球菌多糖-蛋白载体结合物经化学反应，将RSV特异性蛋白连接到重组蛋白载体表面的C端；RSV特异性蛋白为F蛋白，表达F蛋白的序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的RSV-PCV联合疫苗，其特征在于，根据表达蛋白的核酸序列设计特异性引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，引物结合后的待扩增序列如序列表SEQ ID NO：4所示，待扩增序列插入表达载体中，构建表达载体。

3.根据权利要求2所述的RSV-PCV联合疫苗，其特征在于：重组的呼吸道合胞病毒蛋白的表达载体为pcDNA3.1-F。

4.根据权利要求1所述的RSV-PCV联合疫苗的制备方法，其特征在于，所述联合疫苗的制备方法包括如下步骤：

a.分别纯化多种血清型肺炎球菌荚膜多糖；

b.制备并纯化重组载体蛋白；

c.制备RSV特异性蛋白；

d.制备多糖与重组载体蛋白的结合物；

e.将结合后的多糖-载体蛋白经化学反应与RSV特异性蛋白连接；

f.分离纯化步骤e中的RSV-PCV联合疫苗。

5.根据权利要求4所述的RSV-PCV联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤e具体为：将肺炎链球菌多糖-蛋白载体表面功能基团羟基改性为醛基，然后连接RSV特异性蛋白。

6.根据权利要求5所述的RSV-PCV联合疫苗的制备方法，其特征在于：RSV特异性蛋白的制备方法包括如下步骤：

a.培养RSV病毒，采用病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒提取RSV病毒RNA，将提取出的菌体RNA进行逆转录(RT)，以逆转录的cDNA产物为模板进行F蛋白基因序列扩增；

b.根据RSV病毒蛋白表达序列设计特异性引物，特异性引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，重组蛋白的表达载体为pcDNA3.1-F。

7.根据权利要求6所述的RSV-PCV联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤b具体为：根据RSV病毒蛋白表达序列设计特异性引物，上游特异性引物序列如序列表SEQ ID NO：2所示，限制性内切酶位点为Hind III，下游特异性引物序列如序列表SEQ ID NO：3所示，限制性内切酶位点为Xho I，连接后的表达载体为pcDNA3.1-F。