[发明专利]一种荧光探针及其制备方法与在酪氨酸酶检测中的应用

说明书

本发明属于分析检测技术领域，公开了一种荧光探针及其制备方法与在酪氨酸酶检测中的应用。所述荧光探针的系统命名为3,3'‑({5‑[3‑(4‑羟苯基)脲基]‑5H‑苯并[α]吩恶嗪‑9‑基}氮烷二基)二丙酸甲酯，其结构式如式(Ⅰ)所示。本发明荧光探针化合物可用于酪氨酸酶的定性和定量分析，具有良好的检测精度、准确性和很好的抗干扰性。

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种荧光探针及其制备方法与在酪氨酸酶检测中的应用。

背景技术

酪氨酸酶也称为多酚氧化酶，是一种金属酶，在它的活性中心含有两个铜离子，这两个铜离子分别与酶分子中的组氨酸结合。酪氨酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，在动物和微生物中被称为酪氨酸酶，而在植物中一般被称为多酚氧化酶，在不同来源的酪氨酸酶会具有不同的理化性质。在植物中，酪氨酸酶对L-多巴、酚类、木质素等物质的合成起着重要的作用。并且，酪氨酸酶与水果和蔬菜的褐变也有很大的关系。因此对酪氨酸酶的活性检测和调节等进行研究，在食品保鲜、环境监测等多个领域有重要的意义。

目前国内外已经有报道的关于酪氨酸酶的活性测定的方法主要包括分光光度法、荧光检测法、电化学检测法、高效液相色谱法等。

高效液相色谱法用于检测酪氨酸酶，用C18反相色谱柱，先用缓冲液作溶剂，设定流速和柱温。淋洗一段时间后，改变线性梯度，淋洗几分钟。之后柱子用淋洗液冲洗，冲洗完后，继续用开始条件淋洗。在通过UV探测器后，柱子流出物通过在放射化学探测器中的一个250uL流动池收集，作为液体闪烁体。高效液相色谱法检测过程繁琐，且易受干扰。

分光光度法是利用酪氨酸酶催化底物(目前常用底物有L-左旋多巴、邻苯二酚、酪胺等)氧化生成具有棕褐色的相应醌类或者二酚的反应，后者在其特征波长处具有明显的光吸收，因此，根据吸光度与醌类物质浓度之间的线性关系计算出酪氨酸酶的活性。该方法的显著不足之处是灵敏度较低，检测下限较高。

电化学方法用于检测酪氨酸酶：酪氨酸酶催化底物发生氧化还原反应的过程中会有电子的传递，该电子转移所产生的电流可通过伏安法检测电流强度获得伏安图谱。加入不同浓度的酪氨酸酶对应产生的电流信号强度也会不同，因此可与酪氨酸酶浓度之间建立线性关系，进而计算出酪氨酸酶活性。

近年来，荧光法作为一种新型的检测手段备受关注，其具有选择性好、灵敏度高以及即时检测、响应快、设备简单等特点。同时，荧光化合物在化学结构上易于设计、修饰和改进，能满足不同检测样品的需要。因此，荧光法非常适合于酪氨酸酶的分析检测。中国专利(申请号：201610663952.0)制备了一种花菁类小分子探针，该探针能产生很强的荧光信号，在酪氨酸酶的存在下，加入探针，在670nm的激发光照射下，可在700-720nm波长范围发射荧光，从而实现了对酪氨酸酶的荧光增强型检测；但是该荧光探针检测灵敏度欠佳，且其合成步骤繁琐，不适于精确检测酪氨酸酶。研究论文(Analytical chemical,2016,88,4557-4564)报道了一种基于萘二甲酰胺衍生物的荧光探针，该探针在550nm处几乎没有荧光；体系中有酪氨酸酶存在时，氧气将探针分子中的酚羟基氧化成苯醌，进而发生分子内电荷重排，释放出具有荧光的萘二甲酰胺衍生物试卤灵，在425nm的激光照射下，该探针分子在550nm处发射绿色荧光，实现了对酪氨酸酶的荧光恢复型检测；但该荧光探针易受外界因素干扰，难以实现对酶的准确分析。

综上所述，本领域急需发展一种抗干扰性强、准确度高、简便且高效的酪氨酸酶检测方法。

发明内容

为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种荧光探针。

本发明的另一目的在于提供上述荧光探针的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述荧光探针在酪氨酸酶检测中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：