[发明专利]一种荧光探针及其制备方法与在酪氨酸酶检测中的应用

权利要求书

1.一种荧光探针的制备方法，其特征在于：该荧光探针的系统命名为3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯，其结构式如式(Ⅰ)所示：

所述制备方法包括如下步骤：

(1)将4-氨基苯酚和咪唑溶于有机溶剂1中，加入叔丁基二甲基氯硅烷反应，产物经分离纯化，得到4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺；

(2)将步骤(1)所得4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺和三光气溶于有机溶剂2，在惰性气体的保护下，加入N，N-二异丙基乙胺反应，得到中间产物；

(3)在惰性气体的保护下，将9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐溶于有机溶剂2，加入碱性有机化合物，然后加入步骤(2)所得中间产物进行反应，产物经分离纯化，得到3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯；

(4)将3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯溶于有机溶剂3中，加入正丁基氟化铵反应，产物经分离纯化，得到所述荧光探针3,3'-({5-[3-(4-羟苯基)脲基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基}氮烷二基)二丙酸甲酯。

2.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述有机溶剂1为四氢呋喃，所述的反应是指在室温条件下反应30-60min；所述4-氨基苯酚与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1:(1.3-1.4)，所述4-氨基苯酚与咪唑的摩尔比为1:(1.5-1.6)；所述4-氨基苯酚与四氢呋喃的摩尔体积比为1mmol:(3.5-4)ml。

3.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中所述有机溶剂2为二氯甲烷；步骤(2)中所述的反应是指先在-5℃-0℃反应1h，然后在室温条件反应2-3h；步骤(3)中所述的反应是指先在-5℃-0℃反应30min，然后在室温条件下反应24h。

4.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺与三光气的摩尔比为1:4；所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:6；所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺与二氯甲烷的摩尔体积比为1mmol:(45-60)ml。

5.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述碱性有机化合物为三乙胺；步骤(3)中所述9-[双(3-甲氧基-3-丙酰基)氨基]-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-亚胺盐与步骤(2)中所述4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺的摩尔比为(1.1-1.2):1；所述三乙胺与4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯胺的体积摩尔比为(0.15-0.2)ml:1mmol。

6.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述有机溶剂3为四氢呋喃，所述的反应是指在室温条件下反应3-5h；所述3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯与正丁基氟化铵的摩尔体积比为1mmol:(0.5-1)ml；所述3,3'-[(5-{3-[4-(叔丁基二甲基硅杂氧基)苯基]脲基}-5H-苯并[α]吩恶嗪-9-基)氮烷二基]二丙酸甲酯与四氢呋喃的摩尔体积比为1mmol:(100-120)ml。

7.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述分离纯化步骤为：旋蒸除去溶剂，水洗，再用乙酸乙酯萃取，所得有机层用水、饱和氯化钠溶液进行清洗，有机相再干燥，旋蒸除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化；步骤(3)所述分离纯化步骤为：反应液旋蒸除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化；步骤(4)所述分离纯化步骤为：旋蒸除去溶剂，水洗，再用二氯甲烷萃取，所得有机层用水、饱和氯化钠溶液进行清洗，有机相再干燥，旋蒸除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化。