[发明专利]新生儿软骨发育不全与软骨发育低下检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测新生儿软骨发育不全 (Achondroplasia，ACH)与软骨发育低下(Hypochondroplasia，HCH)相关基因突变的检测方法和产品。具体而言是利用整合的多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，来检测孕妇外周血浆游离DNA中胎儿FGFR3基因的第1108位碱基G>T、第1138位碱基G>A和G>C以及第1620位碱基C>A，共计4种突变类型的方法及相应的试剂盒。

背景技术

我国是出生缺陷高发国家，估计目前我国出生缺陷发生率在5.6％左右，每年新增出生缺陷数约90万例，其中单基因遗传病是出生缺陷中最主要的一个类型，根据WHO统计显示，全球出生人口单基因病累计发病率高达10‰。其中先天性软骨发育不全(Achondroplasia，ACH)为典型的常染色体显性遗传的单基因遗传病,出生发病率为1/30 000，没有种族倾向，其中80％～90％的患者为散发型。它是短肢侏儒中最常见的一种疾病，临床表现为身材矮小，头大，前额圆凸，鼻梁下陷，手指呈现三叉状分离等。早期发现并及时终止妊娠是现在减少该病发生的主要手段。

在不断的研究过程中，人们对软骨发育不全(ACH)有了逐步深刻的认识。 Shiang(Mutations in the transmem‐brane domain of FGFR3 cause the most common genetic form of dwarfism，achondroplasia.Cell，1994，78(2)：335‐342)将ACH 的致病基因定位于4号染色体短臂t末端，不久Rousseau等(Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor‐3in achondro‐plasia.Nature，1994，371 (6 494)：252‐254)几乎同时发现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)跨膜区基因第1138位核苷酸的突变是ACH发病的原因。FGFR3有19个外显子和18个内含子，其中第10外显子编码FGFR3跨膜区以DNA测序发现，绝大多数的突变是第1138位核苷酸G>A碱基转换，少数为G>C转换，这两种突变都导致了FGFR3 跨膜区第380位密码子的错义突变(甘氨酸Gly替换为精氨酸Arg)(Cell，1994， 78(2)：335‐342；Nature，1994，371(6494)：252‐254)，是骨关节先天畸形中发生基因突变率最高的。1996年Dau‐Ming Niu等研究发现FGFR3 1138G>A在中国人群中同样也是高频突变，张晔等研究22例ACH患者，其中21例存在1138 位G>A，FGFR3基因第1138位碱基突变的患者中，95％以上为G>A转换，尚有少数发生G>C的颠换，因此检测该点突变可从分子水平上鉴别ACH。

尚有学者发现ACH患者FGFR3基因第10外显子1180A‐T(p.Thr394Ser)新的错义突变，也位于FGFR3基因跨膜区(ZHU B,DONG QM,HUANG XH,et al.Mutation analysis of fibroblast growth factor receptor 3gene in an achondroplasia family[J].Chinese Journal of Medical Genetics,2003,20(5):373‐375)。

此外，近年另有学者分别在欧洲和日本ACH患者中发现了FGFR3基因1123 位G‐T颠换，导致375位密码子的突变，即由半胱氨酸代替了甘氨酸，表明ACH 与其他遗传性疾病一样存在着等位基因的异质性(朱泓，“软骨发育不全的产前诊断研究”，《海南医学》，2010年第21卷第9期)。

一种核苷酸的点突变和一种疾病存在如此高的对应率是及其罕见的，这也保证了软骨发育不全基因诊断的准确性。由于在中国人中，FGFR3基因突变的患者中，95％以上为G1138A转换，尚有少数发生G1138C的颠换，基本上包括了中国人的常见FGFR3基因突变频率(超过99％)，因此以上3种突变类型成为了诊断软骨发育不全基因的主要方向(朱泓，《海南医学》，2010年第21卷第9期； The molecular and genetic basis of fibroblast growth factor receptor 3 disorders.EndocrRev，2000，21(1)∶23‐39)。