[发明专利]新生儿软骨发育不全与软骨发育低下检测试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测胎儿FGFR3基因的4种突变类型的引物组合物，包括如序列SEQ ID NO:1‐18所示的序列：

其中，所述4种突变类型分别是：FGFR3基因的第1108位碱基G>T、第1138位碱基G>A和G>C以及第1620位碱基C>A。

2.权利要求1的引物组合物，其中PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5‐15个碱基，更优选是10bp的tag：ACGTTGGATG。

3.权利要求1或2的引物组合物，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。

4.由权利要求1‐3所述的引物组合物所制备的检测产品，包括检测试剂盒、检测试剂、检测芯片等。

5.权利要求4的检测产品，其中该产品为检测试剂盒，包括：

(1)用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；

(2)用于PCR产物纯化的试剂；

(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。

6.权利要求5的检测产品，其中试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。

7.权利要求6的检测产品，其中用于PCR产物纯化的试剂包括：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱，其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

8.使用权利要求1‐3所述的引物组合物，或权利要求4‐7所述的检测产品来检测新生儿软骨发育不全与软骨发育低下的相关突变位点的方法，包括如下步骤：

(1)多重PCR：使用特异性的PCR引物，在一个反应体系中，对FGFR3基因等目标检测DNA区域同时进行扩增，得到目标检测DNA区域的PCR产物；

(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；

(3)单碱基延伸：使用3条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的目标位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与目标位点处的基因型互补配对；

(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；

(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行进行检测；

其中，所述4个与新生儿软骨发育不全与软骨发育低下相关基因的突变分别是：胎儿FGFR3基因的第1108位碱基G>T、第1138位碱基G>A和G>C以及第1620位碱基C>A这4种突变类型。

9.权利要求8的方法，其中步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。

10.通过权利要求4‐7所述的检测产品检测孕妇外周血浆游离DNA中胎儿FGFR3基因的第1108位碱基G>T、第1138位碱基G>A和G>C以及第1620位碱基C>A，共计4种突变类型。