[发明专利]抗稻瘟病Pi2基因特异性分子标记的开发与应用

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种稻瘟病抗性基因Pi2的特异分子标记的高分辨率熔解曲线分析(High-Resolution Melting Curve Analysis,HRM)，以及利用所述引物检测稻瘟病抗性基因Pi2的方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半的世界人口以稻米为主食。由子囊菌(Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病是广泛发生在世界各稻区影响水稻生产的重要病害之一，每年都会对水稻生产造成巨大损失。从环境保护和农业可持续发展来看，选育和种植抗病品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗病育种严重依赖于抗性鉴定和植株表型的选择，受到育种者经验和病菌发病条件的限制，很容易造成抗病基因的丢失，选择效率往往较低。分子标记辅助选择通过与基因紧密连锁的分子标记的基因型来对目的基因进行选择，因为它不受环境因素的影响，选择基因可靠性极高。近年来，水稻抗稻瘟病基因的克隆取得了重要进展，稻瘟病抗性基因的分子标记的开发对于培育抗稻瘟病水稻品种具有重要意义。

到目前为止，在水稻第6染色体短臂端的Pi2/9基因簇内至少有9个稻瘟病抗性基因(Pi2,Piz,Piz-t,Pi40,Pigm,Pi9,Pi26,Pi50,Pi2-2)己经被定位，这些基因都被认为在稻瘟病抗性育种方面具有重要的应用价值(Jiang et al.,2012)，其中Pi9、Pi2、Piz-t以及Pigm己经被成功克隆(Qu et al.2006,Zhou et al.2006,Deng et al.2016)。Pi2基因源自哥伦比亚籼稻品种5173，是目前已克隆的一个重要稻瘟病显性广谱抗性基因(Liu et al.,2002)，刘士平等(2003)利用收集到的不同地区来源的75个稻瘟病菌株进行接种，发现Pi2的抗谱可高达85.53％。携带Pi2的亲本C101A51对来自于13个国家的43个稻瘟病菌株中的36个表现抗性(Liu et al,2002)。

Pi2编码一个NBS-LRR类蛋白，含有2个内含子，长度分别是3839bp和116bp，Pi2的cDNA全长为3332bp，包含117bp 5'UTR和116bp 3'UTR。Pi2蛋白包含1032个氨基酸，含有1个核苷酸结合位点(NBS)和3个富亮氨酸重复区(LRR)。Pi2所在的基因组区域存在9个抗性基因特征的候选基因，它们在序列上高度同源，核苷酸水平上的序列一致性达到95.6％；在氨基酸水平上，Pi2与Pi9的序列一致性高达96％，Pi2与Piz-t的编码产物仅在3个LRRs区域有8个氨基酸的差异；而在这8突变氨基酸中，仅有1个位于xxLxLxx基序中(Zhou et al.,2006)。

高分辨率熔解曲线分析(High Resolution Melting，HRM)是近些年发展起来的一种单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)以及突变研究技术，是由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的。它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。该检测方法因其操作简便、快速，成本低，无需设计探针，结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。在植物育种上，HRM因为其操作与后期数据分析简单易懂，在突变扫描、基因分型、基于特定基因的种质资源鉴定以及功能标记开发等方面具有广阔的应用前景(罗文龙等，2011)。