[发明专利]一种含抗冻蛋白的细胞冻存液

说明书

技术领域

本发明涉及细胞冻存液领域，具体涉及一种含抗冻蛋白的细胞冻存液。

背景技术

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液 氮中超低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这 样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防 止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的 作用。

在超低温(零下200度)保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、 渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用冷冻保护剂。二甲基亚 砜(DMSO)是一种重要的渗透型细胞保护剂，DMSO能够快速穿透细胞膜进入细 胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶 的形成，从而减少细胞损伤，是目前常用细胞冻存液的主要成分。但DMSO是有 人体和细胞毒性的，并能使细胞产生形态分化。研究表明培养液中DMSO浓度为 10％时,细胞生长抑制率近100％；1‰浓度时抑制率为35％；即使是0.04‰的浓 度,DMSO对细胞的生长也有不利的影响。培养液中残存的DMSO是冻存细胞复苏 后出现细胞毒现象的主要原因。

发明内容

本发明的目的一种不含DMSO的细胞冻存液。使用抗冻蛋白AFP134替代DMSO， 以提高细胞复苏率，降低细胞毒性，保护细胞株的原始特性。

发明内容如下：

一种细胞冻存液，其组分包括：AFP134抗冻蛋白、小牛血清、蔗糖、柠檬 酸钠、灭菌双蒸水。

进一步的，AFP134抗冻蛋白终浓度为0.01mg/ml，小牛血清终浓度为90％， 蔗糖终浓度0.5M/L，柠檬酸钠终浓度为0.05M/L。

进一步的，AFP134抗冻蛋白质量浓度为0.5g/L-2g/L，蔗糖质量浓度为 10g/L-20g/L，柠檬酸钠质量浓度为1g/L-3g/L，小牛血清的体积分数为 70％-95％。

一种细胞冻存液的应用，包括如下步骤：

A、细胞冻存

(1)取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗；

(2)去除PBS，加入适量胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来；

(3)离心1000rpm，离心5min；

(4)去除胰蛋白酶，加入配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计 数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×10⁶/ml～1×10⁷/ml；

(5)将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；

(6)冻存：降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，增至-5℃～ -10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中；也可将装有细胞的冻存管放入 -20℃保存2h，然后放入-70℃冰箱中保存12h，取出冻存管，移入液氮容器内； B、细胞复苏

(1)从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中

(2)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到 离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

(3)离心，转速1000rpm，时间为5min；

(4)弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞 密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

(5)次日更换一次培养液，继续培养。

抗冻蛋白(antifreeze protein，AFP)具有阻止冰晶形成的功能。AFP134具 有冰晶亲和力，能够降低冰晶形成温度，而不影响溶解温度，此外，AFP134利 用自身冰晶亲和面与冰晶结合，从而阻止或抑制冰晶的生长。AFP134还能能够 阻止冰的再结晶，从而避免细胞受到由冰晶导致的机械性损伤。本发明所述的 细胞抗冻液需在-20℃保存，保质期一年。

附图说明：

图1是使用本发明细胞冻存液冻存细胞复苏效果；

图2是使用不含AFP134和DMSO的对照溶液冻存后的复苏效果。

具体实施方式：

(一)冻存液配制：

称取AFP134(终浓度0.01mg/ml)1mg、小牛血清(终浓度90％)90ml、 蔗糖(终浓度0.5M/L)17g、柠檬酸钠(终浓度0.05M/L)1.47g

将上述物质加入到90ml灭菌双蒸水中，定容至100ml

(二)细胞冻存

1.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。