[发明专利]一种含抗冻蛋白的细胞冻存液

权利要求书

1.一种含抗冻蛋白的细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：AFP134抗冻蛋白、小牛血清、蔗糖、柠檬酸钠、灭菌双蒸水。

2.如权利要求1所述的一种含抗冻蛋白的细胞冻存液，其特征在于，所述AFP134抗冻蛋白终浓度为0.01mg/ml，小牛血清终浓度为90％，蔗糖终浓度0.5M/L，柠檬酸钠终浓度为0.05M/L。

3.如权利要求1-2所述的一种含抗冻蛋白的细胞冻存液，其特征在于，所述AFP134抗冻蛋白质量浓度为0.5g/L-2g/L，蔗糖质量浓度为10g/L-20g/L，柠檬酸钠质量浓度为1g/L-3g/L，小牛血清的体积分数为70％-95％。

4.如权利要求1所述的一种含抗冻蛋白的细胞冻存液的应用，其特征在于，包括如下步骤：

A、细胞冻存

(1)取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗；

(2)去除PBS，加入适量胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来；

(3)离心1000rpm，离心5min；

(4)去除胰蛋白酶，加入配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×10⁶/ml～1×10⁷/ml；

(5)将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；

(6)冻存：降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中；也可将装有细胞的冻存管放入-20℃保存2h，然后放入-70℃冰箱中保存12h，取出冻存管，移入液氮容器内；B、细胞复苏

(1)从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中

(2)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

(3)离心，转速1000rpm，时间为5min；

(4)弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

(5)次日更换一次培养液，继续培养。