[发明专利]基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的说，本发明涉及到运用Gateway克隆技术构建质粒载体，该一系列质粒载体带有不同的标签序列和筛选基因GFP，通过转座子系统将目的基因整合到细胞基因组，实现基因的转移。特别涉及一种基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用

背景技术

过表达稳定细胞株是指外源DNA整合到宿主细胞基因组中，可使宿主细胞长期表达目的基因，与瞬转株相比，稳定细胞株能够很大程度上的方便实验研究和降低实验成本。因此，构建基因过表达稳定株在基因功能与机制的研究中被广泛应用。目前构建稳定细胞株主要是通过病毒包装、感染目的细胞的方式来实现的，这种方法耗时长，通常需要两个星期左右。此外，由于所插入的目的基因片段大小受到病毒质粒自身大小的限制，通常目的基因片段大小不能超过3Kb，并且操作人员有感染病毒的潜在安全隐患。与此同时，过表达质粒载体通常采用插入到多克隆位点的方法构建，这种方法不仅效率较低，并且消耗时间长，极大地影响了科研人员的实验进程。

转座子(Transposon)最早是由McClintock于20世纪50年代在研究玉米籽粒的颜色变异中发现的一类不依靠同源重组而能在基因组内和基因组间发生位置改变的DNA序列，因此也被称为跳跃基因或者可移动元件。DNA转座子是其中一种转座机制类型，目前使用较为广泛的DNA转座子类型是Sleeping Beauty转座子。首个有活性的Sleeping Beauty转座子是通过对鱼类基因组中多个失活的Tc1/mariner转座子进行分子重建产生的，该转座子能够插入到AT二碱基区域，并具有插入至内含子中的倾向。此后，为了进一步提高Sleeping Beauty的转座活性，研究人员通过对Sleeping Beauty转座酶基因氨基酸突变的方法对其酶活性进行了广泛的筛选，最终获得了活性增加100倍的Sleeping Beauty突变体(SB100X))。经过改良后的Sleeping Beauty转座子采用“剪切-粘贴”的转座机制，具体的说是：在细胞中，转座酶SB100X识别Sleeping Beauty转座子两端特异的反向重复序列(ITRS)，并将转座子序列切出，然后通过DNA攻击的方式插入新的基因组位置。这种Sleeping Beauty转座子的优点是：构建稳定株不需要包装病毒，大大的缩短了稳定株构建的时间，避免了包装病毒过程中所产生的生物安全问题；同时插入的目的片段大小不受限制；稳定重组效率高。

Gateway克隆技术是由Invitrogen公司开发的一项基因克隆新技术，该技术利用位点特异性重组反应：BP反应和LR反应，并利用大肠杆菌自杀基因ccdB，极大地提高了克隆的效率，同时大大的缩短了构建质粒的时间。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一系列基于转座酶快速建立过表达稳定系的质粒载体。

本发明的另一目的在于满足常规的在真核细胞中表达目的基因的需要，本发明提供的一系列质粒载体中带有Flag、HA、V5或Myc标签序列，这些标签序列的存在使目的基因的Western、免疫荧光、ELISA等的检测通过Flag、HA、V5或Myc抗体即可进行，节省了购买抗体或自行制备抗体的费用和时间，对于进行IP或co-IP也带来了很大的便利。同时本发明提供的一系列质粒载体分为带有筛选基因GFP和不带筛选基因GFP两类，方便流式实验筛选出阳性细胞，同时也可以验证质粒转染的效率。

该质粒载体包括Sleeping Beauty转座子元件(ITRS)，强启动子CAG驱动的ccdB基因元件，ccdB基因元件两侧分别含有重组位点attR1和attR2，在重组位点attR1的上游带有不同标签序列。同时该系列质粒载体分为带有筛选基因GFP和不带筛选基因GFP两类。通过Gateway LR反应生成含带有Sleeping Beauty转座子作用元件(ITRS)，不同标签序列和筛选基因GFP的质粒载体。同时采用该系统能够很好地将目的基因整合到受体基因组中，实现基因的转移。

本发明提供以pSM1.1-HA-Puro-GFP为基础，构建用于基因功能与机制研究的一系列质粒载体。本方法融合了转座子和Gateway克隆技术的优点，可简单高效地用于构建过表达稳定株。

本发明的另一目的在于提供上述质粒载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：