[发明专利]一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法

说明书

本发明公开了一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法，其包括以下步骤：1)制备供试品溶液；2)用色谱和质谱联用的方法对样品进行分析；3)采用特征离子定性鉴别的方法对样品进行鉴定。该技术方案可以对中华穿山甲、树穿山甲、印度穿山甲进行基源鉴定，准确性高、专属性强，克服性状鉴别、DNA检测的不足。

技术领域

本发明涉及一种中药基源鉴定的检测方法，特别涉及一种穿山甲种属鉴定的检测方法及应用，属于药物分析技术及种质资源鉴定领域。

背景技术

《中国药典》2015年版规定穿山甲来源于鲮鲤科动物中华穿山甲Manispentadactyla Linnaeus的鳞甲，具有活血消癥，通经下乳，消肿排脓，搜风通络的功效，用于经闭癥瘕，乳汁不通，痈肿疮毒，风湿痹痛，中风瘫痪，麻木拘挛等症。临床上一般使用它的炮制品：炮山甲和醋山甲。炮山甲是穿山甲生品经砂烫制得；醋山甲是经砂烫醋淬制得。

穿山甲为国家二级野生保护动物，其疗效确切，但饲养难度比较大，药用资源紧缺，药材价格逐年上涨。市场上一些不法商贩用猪、牛、羊蹄甲掺伪，或用走私的印度穿山甲M.crassicaudata和树穿山甲M.tricuspis Linnaeus替代使用或混用，导致穿山甲药材质量参差不齐，市场秩序混乱。然而，由于缺乏专属性鉴别方法和高灵敏度的检测技术，面对上述问题，药品检验和监管部门却束手无策。因此，建立准确性好、灵敏度高、专属性强的穿山甲饮片的质量控制技术和方法，并应用于相关药品的质量控制标准中，对推进我国药材市场质量监管的科学性与有效性，对保障公众用药安全有效、维护市场公平公正以及保护消费者利益等方面有积极的影响。

在穿山甲质量标准及其相关的研究资料中，传统的性状鉴别可区别不同种穿山甲，但性状鉴别属于经验鉴别，可能有人为主观因素的影响，且穿山甲在炮制后变形、变脆、易断，甚至粉碎后的穿山甲成品(穿山甲配方颗粒)、含穿山甲的成方制剂等，在外观性状大小大多不复存在，所以无法判断穿山甲的基源；用PCR-DNA等蛋白质类成分的通用检测方法，专属性不强，穿山甲在炮制过程中，砂烫的温度和时间等因素造成胶原蛋白不同程度的破坏，直接影响上述方法测定结果的稳定性和重现性，且该方法只适用于对正品和纯伪品的鉴别，而对于正品中掺加部分伪品的问题无能为力。因此，需要找到一种新的方法对穿山甲的基源进行鉴定。

发明内容

本发明的目的在于公开一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种鉴定穿山甲种属的液质联用检测方法，其包括以下步骤：

1)制备供试品溶液；

2)用色谱和质谱联用的方法对样品进行分析；

3)采用特征离子定性鉴别的方法对样品进行鉴定。

优选的，穿山甲种属的物种为中华穿山甲，树穿山甲，印度穿山甲。

优选的，制备供试品溶液的方法是：取穿山甲样品，捣碎打粉，过六号筛，称取粉末10mg，置10ml量瓶中，加8M尿素1ml，再加1M的二硫苏糖醇10μl，水浴60℃加热30min，放冷，加入1M的碘乙酰胺30μl，黑暗静置30min，加1％NH₄HCO₃溶液稀释至10ml，加1μg/μl的胰蛋白酶溶液20μl，摇匀，37℃恒温酶解15h以上，即得。

优选的，色谱条件为：以Agilent Zorbax 300SB-C18(3.5μm，2.1×100mm)为色谱柱，流速0.15ml/min，柱温40℃，进样量3μl；以0.1％甲酸-水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～10min，5％～10％B；10～45min，10％～25％B；45～70min，25％～40％B；70～75min，40％～95％B；75～82min，95％B；82～85min，95％～5％B；85～95min，5％B。