[发明专利]一种铁皮石斛利用茎段薄片进行扩繁的方法

说明书

本发明公开了一种铁皮石斛利用茎段薄片进行扩繁的方法。本发明首先将铁皮石斛茎段切割成厚度0.2cm以上的茎段薄片，接种于接种培养基上不经历愈伤组织阶段直接分化获得无菌苗，当无菌苗长至3‑5片叶时，移植到增殖培养基上，可快速获得大量无菌苗。利用该方法进行铁皮石斛的组织培养扩繁，可节约从田间铁皮石斛植株获得无菌苗的时间，快速获得大量遗传背景一致的种苗群体，满足商品苗对扩繁一致性、稳定性的要求。本发明采用茎段薄片0.2cm以上即可，不需要必须有节点，大大增加了外植体的获取数量。

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛扩繁方法，具体是利用茎段薄片不经历愈伤组织阶段直接分化获得无菌苗，进而通过增殖获得大量的无菌苗的扩繁方法，属于农业领域。

背景技术

铁皮石斛为兰科石斛属植物，是传统名贵中药材。近年来随着人们对铁皮石斛的了解越来越多，对铁皮石斛的需求日趋增加，而石斛自然繁殖力极低，种子需与真菌共生才能萌发，加上长期采挖，稀缺的野生资源越来越少。通过组培方法可快速获得铁皮石斛的无菌苗，并通过快速增殖，可以快速获得大量无菌铁皮石斛种苗。

目前通过组培获得铁皮石斛无菌苗的方法有两种：

一是果荚消毒后在培养基上播种获得无菌苗，此方法获得无菌植株为杂交后代，每个个体的基因型都存在差异，在商品化生产中无法满足对种苗一致性的要求；

二是通过外植体消毒，经过愈伤组织培养、分化培养、增殖培养获得遗传背景稳定，变异系数小的大量无菌植株，此方法经历愈伤组织培养、分化培养两个阶段，时间较长；并且，已报道的此类方法，需要选择距离节左端和右端各0.5-1cm左右的茎段，同样长度的外植体获得的无菌苗数量较少。

因而，急需继续寻找一种优良的铁皮石斛组培快繁方法，既能快速获得大量的无菌植株，又能保持遗传性状的稳定。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种铁皮石斛利用茎段薄片进行扩繁的方法。本发明首先将铁皮石斛茎段切割成厚度0.2cm以上的茎段薄片，接种于接种培养基上不经历愈伤组织阶段直接分化获得无菌苗，当无菌苗长至3-5片叶时，移植到增殖培养基上，可快速获得大量无菌苗。利用该方法进行铁皮石斛的组织培养扩繁，可节约从田间铁皮石斛植株获得无菌苗的时间，快速获得大量遗传背景一致的种苗群体，满足商品苗对扩繁一致性、稳定性的要求。

本发明的技术方案：一种铁皮石斛利用茎段薄片扩繁的方法,其特征是,

1)培养基制备

接种培养基为：MS+6-BA 0.125-0.25mg/L+NAA 0.125-0.375mg/L+2,4-D 0.5-1.5mg/L+KT 0.125-0.25mg/L；

增殖培养基为：蒸馏水+花宝1号1.4-1.6g/L+花宝2号0.30-0.35g/L+牛骨蛋白胨1.5-1.6g/L+活性炭1.5-1.6g/L+MS母液中的6、7部分各10-12ml/L+蔗糖18-20g/L+琼脂粉5.5-6.0g/L+香蕉泥100-120g；

2)外植体预处理与接种培养

采用健康铁皮石斛的茎段作为外植体，将外植体洗涤、灭菌后将茎段横切为厚度0.2cm以上的茎段薄片，然后接种于接种培养基上光培养25±2天，即可见到芽，继续光培养使石斛在组培瓶内生长，至55天左右时，无菌苗可长出3-5片叶，可进行增殖；

3)无菌苗接种

当无菌苗长出3-5片叶时，将无菌苗移植到装有增殖培养基的组织培养瓶中，光培养15-25天，每棵无菌苗可分生出20-30棵小苗；

4)壮苗培养、生根培养和出瓶炼苗