[发明专利]RSV-PCV疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了一种RSV‑PCV疫苗及其制备方法，包括：RSV(呼吸道合胞病毒)免疫中间体，所述RSV免疫中间体的抗原为可引起机体免疫反应的RSV膜表面融合蛋白F和/或附着蛋白G，其中表达蛋白抗原的核酸序列重组在核酸载体上，重组蛋白的核酸序列以减毒胞内细菌为细菌载体；PCV(肺炎球菌)免疫中间体，所述PCV免疫中间体包括肺炎球菌多糖抗原及蛋白载体，其中蛋白载体为重组蛋白载体，由大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白及霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白(CTB)重组获得，LTB核酸序列与CTB核酸序列通过引物序列桥接，编码的载体蛋白序列如序列表SEQ ID NO：8所示；上述组分的免疫中间体分别制备，临用混合。

技术领域

本发明涉及一种RSV-PCV疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

一、呼吸道合胞病毒及其流行病学

呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而流感病毒(Influenza virus，FLU)和呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)则是重要的呼吸道病原体。目前，流感已有安全有效的不同类型疫苗，为流感的防控提供了保证。而RSV由于自身免疫特性，投入临床的疫苗很少，为其防控提出了挑战。至今仅有美国MedImmune公司研制生产的流感三价减毒活疫苗通过FDA审批。RSV是婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和肺炎死亡的重要原因。据统计，6个月以内的婴幼儿因RSV感染导致住院达70％，2周岁以内的儿童甚至高达99％。RSV因其致病范围广，病情高发，且会引起严重的并发症等，给人类健康和生命安全造成了严重威胁。世界卫生组织已将RSV疫苗定为优先发展的疫苗之一。

RSV属副粘病毒科肺病毒属，是非节段性单股负链RNA病毒，含A、B两个血清型。RSV基因组全长约15Kb，编码10种主要蛋白，分别由三个跨膜蛋白(G、F和SH)、两个基质蛋白(M和M2)、三个核衣壳蛋白(N、P和L)及两个非结构蛋白(NS1和NS2)构成，其中融合蛋白F(Fusion protein，F)和附着蛋白G(Attchment protein，G)是RSV激发机体产生保护性抗体最重要的病毒蛋白。G蛋白高度变异，并非感染和细胞融合所必须的；的F蛋白高度保守，介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，使得病毒成功入侵宿主细胞并且还可引起相邻细胞质膜间的融合促进体外合胞体的形成。针对RSV F和G糖蛋白的全身性中和抗体能有效防止RSV再感染，因此RSV F和G蛋白已作为公认的保护性抗原和毒力致病分子。

对于RSV而言，20世纪60年代，Fulginiti VA等研制的福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)由于诱发Th2型免疫过激导致2名儿童死亡和80％住院，以失败告终。目前RSV疫苗的研究主要集中在载体疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗，已有多种疫苗类型正在研制，但至今无获批的RSV疫苗可用。RSV疫苗的研究一直是国际社会关注的焦点，从已有的研制中的RSV疫苗可见，注射免疫不能产生有效的粘膜和细胞免疫反应且免疫保护效果受限、DNA疫苗存在潜在安全性以及全长F、G蛋白疫苗存在潜在Th1/Th2失平衡等瓶颈问题亟待解决。阻碍RSV疫苗研制的主要障碍有以下几点：一是大多数动物模型包括黑猩猩等均为半许可感染/复制模型，因此难以完全再现RSV的致病性；二是作为疫苗主要目标人群的新生儿免疫系统发育不成熟，同时体内存在的母传抗体能介导免疫干扰；三是RSV存在两种不同抗原亚型，而且自然感染难以产生有效的免疫保护作用；四是福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)不仅不能防止婴幼儿感染，在嗣后的自然感染中，接种疫苗的儿童病情加重(即疾病增强作用)、甚至死亡。

近年来的研究表明，以载体为基础构建的RSV活载体疫苗是目前有望用于新生儿的RSV候选疫苗RSV。活载体疫苗的种类主要包括病毒载体疫苗和细菌载体疫苗。RSV病毒载体疫苗主要包括：痘苗病毒(vaccinia virus)载体疫苗、腺病毒(adenovirus，Ad)载体及副黏病毒(paramyxovirus)载体疫苗等，近年来，腺病毒载体疫苗和副黏病毒载体疫苗受到广泛关注。

二、肺炎球菌及其流行病学