[发明专利]RSV-PCV疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种RSV-PCV疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括：

a.RSV(呼吸道合胞病毒)免疫中间体，所述RSV免疫中间体的抗原为可引起机体免疫反应的RSV膜表面融合蛋白F，其中表达蛋白抗原的核酸序列重组在核酸载体上，重组蛋白的核酸序列以减毒胞内细菌为细菌载体；表达F蛋白序列的基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示，根据表达蛋白的核酸序列设计特异性引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3所示，引物结合后的待扩增序列如序列表SEQ ID NO：4所示，转染RSV抗原的细菌载体为SL7207/pcDNA3.1-F；

b.PCV(肺炎球菌)免疫中间体，所述PCV免疫中间体为肺炎球菌多糖抗原及蛋白载体，其中蛋白载体为重组蛋白载体，由大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白及霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白(CTB)重组获得，LTB核酸序列与CTB核酸序列通过引物序列桥接，编码的载体蛋白序列如序列表SEQ ID NO：10所示；编码的重组载体蛋白的基因序列如序列表SEQID NO：9所示，如序列表SEQ ID NO：9所示的载体蛋白为LTB蛋白的C端连CTB蛋白的N端，LTB基因与CTB基因之间通过引物连接，LTB基因的R端引物序列如序列表SEQ ID NO：12所示，CTB基因的F端引物序列如序列表SEQ ID NO：13所示；LTB基因的F端引物序列如序列表SEQID NO：11所示，CTB基因的R端引物序列如序列表SEQ ID NO：14所示；所述肺炎球菌多糖抗原是分离提纯血清型肺炎球菌荚膜上的多糖，所述肺炎球菌的血清型为4、6B、9V、14、18、19F和23F；

上述组分的免疫中间体分别制备，临用混合。

2.根据权利要求1所述的RSV-PCV疫苗，其特征在于：肺炎球菌荚膜糖的每种血清型与蛋白载体之间的质量比为1.5～4.5:1。

3.根据权利要求1所述的RSV-PCV疫苗，其特征在于：RSV免疫中间体及PCV免疫中间体均为冻干粉剂，临用混悬。

4.根据权利要求1所述的RSV-PCV疫苗的制备方法，其特征在于，所述RSV免疫中间体的制备方法包括如下步骤：

a.培养RSV病毒，采用病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒提取RSV菌体RNA，将提取出的菌体RNA进行逆转录(RT)，以逆转录后的cDNA产物为模板进行F蛋白基因序列扩增；

b.根据RSV病毒蛋白表达序列设计特异性引物，特异性引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，重组抗原蛋白的表达载体为pcDNA3.1-F；

c.将表达载体转染至减毒沙门氏菌SL7207中，构建抗原SL7207/pcDNA3.1-F。

5.根据权利要求1所述的RSV-PCV疫苗的制备方法，其特征在于，PCV免疫中间体的制备方法包括如下步骤：

a.根据LTB和CTB的CDS区核酸序列，PCR扩增后，通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，凝胶回收LTB-CTB片段和表达载体pET28a，构建pET28a-LTB-CTB质粒；

b.将所述质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选阳性克隆后进行单克隆扩增，IPTG诱导后鉴定；

c.取制备好的肺炎球菌荚膜多糖及重组载体蛋白，以重组LTB-CTB载体蛋白与多糖以1：2质量比混合反应。