[发明专利]一种从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素-2标准样品的方法

说明书

本发明公开了一种从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素‑2标准样品的方法，包括下列步骤：1）大规模培养藻液破碎；2）毒素提取；3）葡聚糖凝胶色谱柱分离；4）扇贝毒素‑2高效液相色谱分离；5）扇贝毒素‑2高效液相色谱纯化；6）检验所述标准样品的均匀性和稳定性。本发明采用高效液相色谱法制备扇贝毒素‑2，前处理简单快捷，易于操作；收集方法简单；制备的标准样品均匀稳定，且纯度达90%以上。

技术领域

本发明涉及一种贝类毒素标准样品及其制备方法，具体的说，涉及一种从鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素-2标准样品的方法，属于生物技术领域。

背景技术

扇贝毒素(Pectenotoxins,PTXs)是一类聚醚类大环内酯结构的脂溶性化合物，呈现7个小环醚结成的环状结构，在2004年柏林召开的海洋生物毒素会议上，FAO/IOC/WHO将其列为八大类海洋生物毒素中的一类。扇贝毒素-2(PTX2)是扇贝毒素类中最常见的的一种，化学式为C₄₇H₇₀O₁₄，分子质量为859.07，[M+NH₄]⁺：m/z 876.5104。扇贝毒素-2主要由海洋甲藻中的鳍藻(Dinophysis spp.)产生，如鳍藻Dinophysis acuta，D.fortii，D.acuminata，D.caudata，D.norvegica，D.rotundata和D.infundibulus等，于1984年首次从日本的养殖扇贝Patinopecten yessoensis中鉴定发现，后在全球各地的贝肉和海水中广泛检出。研究发现这种毒素可导致小鼠腹腔注射高致死率，此外有研究发现其对几株人类肺癌细胞的具有潜在细胞毒性。因此，欧盟规定各种水产品的可食用组织中OA，DTXs和PTXs的含量总和不能超过160μg/kg，但包括中国在内的许多国家和地区尚没有专门针对PTXs毒素的检测规范和食用安全标准。

目前尚未发现扇贝毒素-2的标准制备技术的报道，我国缺乏扇贝毒素的组分结构、分布规律的背景研究资料，国内检测海洋生物毒素的标准样品主要依赖从国外进口，其中加拿大国家研究委员会(NRC)下属的海洋生物科学研究所(IBM)提供的扇贝毒素的标准物质，已被包括我国在内的40多个国家的海产品和水质实验室采用。此外美国SIGMA公司也成功建立腹泻性贝类毒素OA的标准品制备工序。购买国外标准毒素价格昂贵且含量很少，但是国内的快速检测试剂开发需要大量标准品。总的来说，我国在海洋生物毒素标准品的研制方面鲜见报道，仅见有麻痹性海洋生物毒素标准样品制备专利1项。因此，为加强和建立我国贝毒流行病学管理系统、有效地预防和控制我国贝毒事件的发生，急需海洋生物毒素的标准物质制备技术。

发明内容

本发明针对当前市售扇贝毒素标准品的不足，所要解决的技术问题是：提供一种从大规模培养藻液中提取、分离纯化扇贝毒素-2的简单快捷，易于操作的高效液相制备技术方法。

本发明还提供一种应用本方法制备的扇贝毒素-2的标准样品。

本发明还提供该扇贝毒素-2标准样品的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供的大规模鳍藻培养藻液中扇贝毒素-2标准品的液相制备方法，采用如下技术方案：

1)大规模培养藻液破碎：

取前期培养的中国株鳍藻Dinophysis acuminata(DAYS01-E6,F2)的大规模培养液，过10～15μm滤膜后于-196℃左右液氮下冷冻。待冷冻完全后，再将其置于室温下解冻。待解冻完全再反复进行2次冻融。取室温解冻完全的藻液，置于冰水中，在冰浴条件下，使用超声波细胞破碎机进行细胞破碎。超声波细胞粉碎机的实验条件为：超声功率200～325W、超声频率为10～25kHz、总工作时间15～20min，超声波处理时样品温度15～30℃，仪器连续工作时间90～150min。