[发明专利]一种从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素-2标准样品的方法

权利要求书

1.一种从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素-2标准样品的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）大规模培养藻液破碎：

取中国株鳍藻的大规模培养液，过10~15μm滤膜后于-196°C左右液氮下冷冻；待冷冻完全后，将其置于室温下解冻；解冻完全再反复进行2次冻融；

取室温解冻完全的藻液，置于冰水中，在冰浴条件下，使用超声波细胞破碎机进行细胞破碎；

2）毒素提取：

取经过破碎处理的藻液，依次用乙醚和二氯甲烷各萃取两次，经旋转蒸发浓缩后，合并提取液，进行进一步分离与纯化；

3)葡聚糖凝胶色谱柱分离：

取经有机试剂提取后的扇贝毒素样品提取液，加入活化后的葡聚糖凝胶柱，以甲醇洗脱，分段收集；根据HPLC-MS/MS分析结果，选取含有扇贝毒素-2的组分合并、浓缩，进行进一步的高效液相色谱的纯化；

4）扇贝毒素-2高效液相色谱分析：

采用高效液相色谱法的分离条件：采用C18色谱柱，流动相组成为A：纯水，含6.7mM氨水；B：乙腈/水，体积比为90:10，含6.7mM氨水；流速为1mL/min，柱温为40°C；确定目标色谱峰；

5）扇贝毒素-2高效液相色谱制备：

色谱柱： C18柱，长250mm，内径4.8mm，粒度5μm；

流动相：A：纯水，含有6.7mM氨水；B：色谱纯乙腈/水，体积比为90:10，含有6.7mM氨水；

流速：1mL/min；

柱温：40°C；

检测波长:235nm；

根据扇贝毒素-2的保留时间进行收集；将收集的组分利用旋转蒸发工艺去除试剂，即得扇贝毒素-2标准品。

2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，1）中使用超声波细胞破碎机进行细胞破碎的条件为：超声功率200~325 W、超声频率为10~25kHz、总工作时间15~20min，超声波处理时样品温度15~30°C，仪器连续工作时间90~150 min。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤2）毒素提取的方法是：取经过破碎处理的藻液30mL倒入分液漏斗，先用30～40mL乙醚萃取：再加30～40mL乙醚，进一步萃取，充分震荡后，静置5～10min,将水从下口放出，提取毒素的乙醚溶液从上口倒出；再用30～40mL二氯甲烷萃取两次，二氯甲烷萃取时，充分震荡后，静置5～10min,提取毒素的二氯甲烷从下口接出；使两相液层充分接触振荡操作：把分液漏斗倾斜，使漏斗的上口略朝下，倒置45°角，用力振荡的目的是使水与提取的有机溶剂充分混合；合并萃取液加入无水硫酸钠或无水硫酸镁除水，离心过滤除去干燥剂，35～40℃旋转蒸发浓缩，蒸去溶剂，甲醇溶解后备用。