[发明专利]一种男性血源性自体精原干细胞的制备方法和试剂盒及应用

说明书

本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及一种使男性的血液细胞逆向分化产生血源性自体精原干细胞的制备方法、干细胞及其应用。所述的制备方法通过将自体细胞作为原料细胞依次经细胞培养液S1、细胞培养液S2和细胞培养液S3培养后得到血源性自体精原干细胞。本发明应用人自体血液细胞作为更方便更简易的逆向分化生产人自体精原干细胞的自体原料细胞。本发明应用小分子物质组成的细胞培养液配方，在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，快速使人的自体血液细胞逆向分化产生人血源性精原干细胞。本发明在男性血源性自体精原干细胞的生产速度、产量、纯度方面均明显优于现有技术。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及一种使男性的血液细胞逆向分化产生血源性自体精原干细胞的制备方法、干细胞及其应用。

背景技术

干细胞(Stem Cell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(Embryonic StemCell，ES细胞)和成体干细胞(Somatic Stem Cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类:全能干细胞(Totipotent Stem Cell，TSC)、多能干细胞(Pluripotent Stem Cell)和单能干细胞(Unipotent Stem Cell)。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为万用细胞。

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性生殖细胞的母细胞，是雄性成体干细胞中唯一与下一代遗传背景密切相关的细胞，具有极强的自我更新与分化能力。精子与卵子结合形成受精卵，受精卵不断分裂和分化形成生命个体。近年来，生育能力低下或不孕影响10％—15％的育龄夫妇，其中男性因素占40％—60％。哺乳动物生殖细胞在发育过程中经减数分裂形成单倍体精子或卵子，精子发生是一个复杂而高度有序的过程，若其中任一阶段出现错误，会导致生育能力低下或不育。辅助生殖技术虽可为部分男性不育患者带来后代，但并未从根本上解决男性不育问题，特别是因自身缺乏内源性生殖细胞而导致的无精子症或精子畸形综合症患者，因不能产生生殖细胞或健全的单倍体精细胞而不能采用辅助生殖技术或药物来治疗。精原干细胞对男性生殖腺的结构具有再生性修复作用，所以，自体精原干细胞的生产技术在男性生殖系统的疾病和损伤的治疗领域、在男性不孕不育的修复治疗应用领域、在精巢抗衰老保健领域以及建立自体精原干细胞储存库领域的应用，都有着十分重要的价值和意义。

胚胎干细胞技术和体外诱导多能干细胞(iPS细胞)定向分化为雄性生殖细胞技术的研究给部分男性不育患者带来了希望；小鼠ESCs、灵长类ESCs和人的ESCs(hESCs)可在体外可诱导分化为原始生殖细胞(primal germ cells,PGCs)。此外，最近的研究表明人类多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSCs)能够进入减数分裂且在某些情况下可产生单倍体细胞。但因ESCs存在取材困难、免疫排斥、伦理道德等问题，iPS细胞则成为研究热点。但是，iPS细胞体外诱导为雄性生殖细胞的应用前景及存在的问题。首先是安全性，科学家最初使用逆转录病毒(retrovirus)进行多能干细胞诱导，后用慢病毒、腺病毒和质粒来替代，逆转录病毒与慢病毒可随机改变人体细胞的遗传物质，易导致基因异常而致癌化。因而，缺乏一种安全有效的精原干细胞的制备或生产方法。

发明内容

针对现有技术中获取的男性自体精原干细胞技术来源困难、工艺复杂、耗时长、数量少、安全性疑虑的问题，本发明提供了一种男性血源性自体精原干细胞(血源性自体生殖干细胞)的制备方法，该方法简便、快速、安全、产量大。

一个方面，本发明提供了一种男性血源性自体精原干细胞的制备方法，所述的制备方法包括：

(1)将自体来源的细胞作为原料细胞以1×10⁶～5×10⁶的密度接种于细胞培养皿中；