[发明专利]一种男性血源性自体精原干细胞的制备方法和试剂盒及应用

权利要求书

1.一种男性血源性自体精原干细胞的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：

(1)将自体来源的细胞作为原料细胞以1×10⁶～5×10⁶的密度接种于细胞培养皿中；

(2)在37℃和5％的CO₂的环境中，将原料细胞在细胞培养液S1中培养3天，得到细胞1；所述的细胞培养液S1为含有以下成分的RPMI 1640培养液：

2～10％的Knockout血清替代品、1～1000ng/mL的促红细胞生成素、1～1000ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子、1～1000ng/mL的粒细胞集落刺激因子、1～1000ng/mL的白细胞介素-3、1～1000ng/mL的白细胞介素-6、1～1000ng/mL的干细胞因子、1～1000ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、1～1000ng/mL的Nanog蛋白、1～1000ng/mL的Oct4蛋白、1～1000ng/mL的Sox2蛋白和1～1000ng/mL的C-myc蛋白；

(3)在37℃和5％的CO₂的环境中，将步骤(2)得到的细胞1再于细胞培养液S2中培养3～6天，得到细胞2；所述的细胞培养液S2为含有以下成分的M2培养液：

2～10％的Knockout血清替代品、1～1000ng/mL的Nanog蛋白、1～1000ng/mL的Oct4蛋白、1～1000ng/mL的Sox2蛋白、1～1000ng/mL的C-myc蛋白、1～1000ng/mL的生殖细胞特异性蛋白DDX4/MVH、1～1000ng/mL的Dazl蛋白、1～1000ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、1～1000ng/mL的表皮细胞生长因子、1～1000ng/mL的白细胞介素-6、1～1000ng/mL Sox17蛋白、1～1000ng/mL的VASA蛋白、1～1000ng/mL的干细胞因子和1～1000ng/mL的粒细胞集落刺激因子；

(4)在37℃和5％的CO₂的环境中，将步骤(3)得到的细胞2再于细胞培养液S3中培养3～6天，得到细胞3，所述的细胞培养液S3为含有以下成分的M16培养液：

2～10％的Knockout血清替代品、1～1000μM的烟酸、1～1000ng/mL的DMC1蛋白、1～1000ng/mL的PRDM1蛋白、1～1000ng/mL的磷酸甘油酸酯激酶2、1～1000ng/mL的睾酮、1～1000ng/mL的卵泡刺激素、1～1000ng/mL的生殖细胞特异性蛋白DDX4/MVH、1～1000ng/mL的Dazl蛋白、1～1000ng/mL的Oct4蛋白、1～1000ng/mLSox17蛋白、1～1000ng/mL的VASA蛋白、1～1000ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、1～1000ng/mL的成纤维细胞生长因子2、1～1000ng/mL的成纤维细胞生长因子7、1～1000ng/mL的骨形态发生蛋白2、1～1000ng/mL的骨形态发生蛋白4、1～1000ng/mL的白细胞介素-6、1～1000ng/mL的神经营养因子4、1～1000ng/mL的胶质细胞源性神经营养因子、1～1000ng/mL的活化素A、1～1000ng/mL的泛酸、1～1000ng/mL的17α，20β-双羟孕酮、1～1000ng/mL的AY9944-A-7、1～1000ng/mL的表皮细胞生长因子、1～1000ng/mL的血管内皮生长因子、1～1000ng/mL的干细胞因子、1～1000ng/mL的胰岛素样生长因子I、1～1000ng/mL的胰岛素样生长因子II、1～1000ng/mL的生长激素释放因子、1～1000ng/mL的Ifitm3蛋白、1～1000ng/mL的生长激素、1～1000ng/mL的地塞米松和1～1000ng/mL的粒细胞集落刺激因子；

(5)轻轻吹打依次在细胞培养液S1、细胞培养液S2及细胞培养液S3中培养后得到的细胞3，使细胞3完全悬浮后，收集细胞3于离心管中，进行离心操作，然后使用生理盐水对悬浮的细胞3进行清洗操作，重复清洗操作3次后，将细胞3悬浮于生理盐水中，即得到男性血源性自体精原干细胞。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的自体来源的细胞为男性的脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞、或脂肪细胞。