[发明专利]Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制备方法

说明书

本发明属于多肽合成领域，具体涉及Suc‑Ile‑Glu(γ‑Pip)‑Gly‑Arg‑pNA·HCl的制备方法。该方法采用双烯丙氧羰基(bis‑Alloc)对精氨酸的胍基进行保护，从而使其不受酸碱的影响；先将对苯二胺连接在氨基酸上，然后再以过氧化氢和三氟乙酸酐对其氧化，从而提高了对硝基苯胺与氨基酸缩合的收率、安全性和环保性。对各氨基酸采用适宜的保护基，从而提高了反应过程的稳定性。本发明提供的方法具有工艺环保、安全、收率高、制备成本相对较低等优点，适合于大批量制备。

技术领域

本发明属于多肽合成领域，具体涉及Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制备方法。

背景技术

Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl是一种人工合成可以被活化X因子(factor Xa)催化水解的多肽化合物，其简称为S-2732，常作为发色底物。该底物可用于凝血因子Xa和肝素抗Xa活性的定量检测，因此其在科研和临床上都有着广泛的用途。

现有文献未发现有关S-2732合成的报道，查阅其他相关的合成文献，可以发现将发色基团对硝基苯胺连接到氨基酸上是S-2732合成的关键点之一。这是因为对硝基苯胺上的硝基具有强吸电子作用，导致对硝基苯胺的亲核性非常差，通过一般的酰胺缩合方法，其产物收率往往很低。为了解决这一难题，有研究采用三氯氧磷作为缩合剂，将对硝基苯胺高效率地连接到氨基酸上。但是这种方法有着自身的缺陷：一是对硝基苯胺的毒性很大，在使用过程中对人体或者环境具有重大安全隐患；二是所用的缩合剂三氯氧磷的毒性也很大，这显然对大批量生产产生不利的影响。

精氨酸的胍基具有强亲核性和碱性，在多肽合成中须加以保护。从现在文献中可以找到的许多胍基保护基团：叔丁氧羰基、硝基、甲苯磺酰基、三氟乙酰基、苄氧甲酰基保护以及固相合成中使用较多的苯磺酰基类等。精氨酸具有多个活性基团，因此需要多个保护基团。但上面提到的保护基团都具有在酸性或者碱性条件下脱除的性质，这显然是不利于多肽合成。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供发色底物S-2732的制备方法，本发明提供的方法收率高，纯度大。

本发明提供的Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制备方法包括：

过氧化氢、三氟乙酸酐与Fmoc-Arg(Alloc)₂-pPDA反应，制得Fmoc-Arg(Alloc)₂-pNA；

Fmoc-Arg(Alloc)₂-pNA依次与Gly、Ile-Glu(γ-pip)和琥珀酸酐缩合后，经脱保护、成盐制得Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl。

本发明实施例中，所述过氧化氢和三氟乙酸酐与Fmoc-Arg(Alloc)₂-pPDA的摩尔比为(5～6)：(6～7)：(1～1.5)。

本发明实施例中，所述反应的溶剂为二氯甲烷，所述过氧化氢为质量分数为90％的过氧化氢水溶液；所述反应具体包括：过氧化氢与三氟乙酸酐在冰浴的二氯甲烷中混合，室温搅拌30min后，滴加Fmoc-Arg(Alloc)₂-pPDA的二氯甲烷溶液，加热回流1h。

由于硝基的强吸电子作用，亲核性非常差，一般的酰胺键合成方法很难缩合成功。同时对硝基苯胺属于高毒性物质，不利于生产和制备。本发明先将对苯二胺连接在氨基酸上，然后再对其氧化，从而将发色基团对硝基苯胺连接到精氨酸上，这种缩合方式比较环保、安全，收率在80％以上。

本发明实施例中，所述Fmoc-Arg(Alloc)₂-pPDA的制备方法为将Fmoc-Arg(Alloc)₂-OH以HOBt、DIEA和EDCI活化后，与对苯二胺室温反应8～12h。