[发明专利]富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法

说明书

本发明公开了富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，利用磷酸纤维素为柱料，色谱柱运行缓冲液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、300毫摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，洗脱液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、1摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，实现对5种低丰度蛋白的同时富集。采用高效液相色谱联合高分辨质谱对富集后样品进行检测，可鉴定上述5种低丰度蛋白并进行定量分析。本发明方法的富集效果明显，方法简便，不需要使用昂贵的设备或耗材，成本低廉，便于推广和应用；不需要使用抗体，可以大大降低检测的费用，也可避免由于抗体质量稳定性问题带来的不确定性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及血浆或血清中的低丰度蛋白的富集方法。

背景技术

蛋白质组学能高通量地对蛋白质进行研究，可用于发现多种疾病诊断标志物和药物靶点。国际人类蛋白质组研究组织(Human Proteomic Organization,HUPO)早在2002年即启动了人类血浆蛋白质组计划(human plasma proteome project,HPPP)，其科学目标包括全面分析人类血浆和血清蛋白成分，确定不同人种血浆蛋白质的差异程度，以及确定不同生理和病理状态下的个体差异。然而，血浆蛋白质丰度差异巨大，血浆中21种主要高丰度及中等丰度的蛋白，如白蛋白、IgG、ɑ1抗胰蛋白酶、ɑ2巨球蛋白、转铁蛋白等占血浆总蛋白含量的99％以上，而其余的1％则由数千种低丰度甚至极低丰度的蛋白质组成。如白细胞介素6通常浓度范围在0～5ng/L，而白蛋白丰度为(35～50)×10⁹ng/L，高低丰度蛋白含量可差10¹²之巨，远远超出了二维电泳(two-dimensional electrophoresis,2DE)及其他蛋白质组学技术所能测定的范围。

人体组织器官发生病变时，来自病变组织或细胞的蛋白会进入到血液系统，这些蛋白质与机体的病理、生理状况密切相关，因此，对这些蛋白质进行检测和分析是发现与各种疾病相关生物标志物的最有价值样本之一，这些蛋白质包括不少低丰度蛋白，其蛋白浓度在ng/mL量级或更低。本发明中我们关注以下5种低丰度蛋白，这五种蛋白在血浆中的浓度都低于1μg/mL：

1.血管生成素(angiogenin,ANG)：是一个由123个氨基酸组成的核酸酶，可刺激血管生成，在肿瘤发展中起着非常重要的作用，与神经退行性疾病也密切相关。

2.髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)：是血红素过氧化物酶超家族成员之一，主要存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中。髓过氧化物酶的基因多态性与多种疾病的易感性有关，其表达水平的升高与患冠状动脉疾病易感性相关，还可以预测早期患心肌梗死的危险性。髓过氧化物酶与肺癌也存在相关性。

3.乳铁蛋白(lactotranferrin,LTF)：是铁传递蛋白家族中的一种多功能糖蛋白，主要存在于各种分泌液中。乳铁蛋白具有抗菌和抗病毒的功能，是先天免疫系统的重要成员，还能与DNA、RNA和多糖分子相互作用，参与许多重要生理过程。有研究认为乳铁蛋白是潜在的卵巢癌早期诊断的生物标志物。

4.脂质运载蛋白2(lipocalin 2,LCN2)：是一个在先天免疫中起重要作用的蛋白，中性粒细胞中有表达，在肾脏、前列腺、呼吸道和胃肠道中也有低水平的表达。在急性肾损伤发生时，血液和尿液中的LCN2浓度会迅速升高，因而LCN2可作为急性肾损伤的生物标志物。此外，在慢性肾病、肾移植等过程中也可以作为诊断标志物。

5.乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)：可在细胞表面或细胞外基质中将硫酸乙酰肝素降解为短链多糖。此蛋白在肿瘤的生长、转移和血管生成中起着重要的作用，因而有研究认为乙酰肝素酶是潜在的肿瘤药物标靶。在乳腺癌、卵巢癌等很多种肿瘤中，HPSE表达上调，且与预后存在一定关联，是可能的肿瘤标志物。

在临床检验实践中，这些低丰度蛋白较难检测，如何有效地检测和分析低丰度蛋白一直是分析科学领域具有挑战性的难题。