[发明专利]富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法

权利要求书

1.富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，所述5种低丰度蛋白为血管生成素、髓过氧化物酶、乳铁蛋白、脂质运载蛋白2、乙酰肝素酶，包括以下步骤：

(1)将柱料装至离心管中，并向所述离心管中加入氢氧化钠和氯化钠的溶液对所述柱料进行碱处理，再向所述离心管中加入盐酸溶液对所述柱料进行酸处理；然后，向所述离心管中加入色谱柱运行缓冲液，悬浮所述柱料并静置后离心弃上清，重复多次；最后，向所述离心管中加入所述色谱柱运行缓冲液，悬浮所述柱料后装到空柱中，得到色谱柱并封闭其出口；

(2)按照每100微升血浆或血清对应5毫升色谱柱运行缓冲液的比例，用所述色谱柱运行缓冲液稀释血浆或血清，然后上样至所述色谱柱，孵育后，打开所述色谱柱出口使液面下降，待液面降至所述柱料时，加入所述色谱柱运行缓冲液清洗，重复清洗多次；

(3)向所述色谱柱中加入洗脱液，孵育后，打开所述色谱柱出口，收集洗脱组分；

其中，

所述柱料为磷酸纤维素；

所述色谱柱运行缓冲液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、300毫摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，溶剂是超纯水，pH值为8.0；

所述洗脱液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、1摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，溶剂是超纯水，pH值为8.0。

2.如权利要求1所述的富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述碱处理具体如下：

①向装有1克磷酸纤维素柱料的50毫升离心管中加入50毫升含有0.05摩尔/升氢氧化钠和0.5摩尔/升氯化钠的溶液，晃动进行混合，浸泡5分钟；

②将所述离心管放入离心机在1000g离心1分钟，倒掉上清液；

③向所述离心管加入50毫升超纯水，悬浮所述柱料，放入离心机在1000g离心1分钟后测量上清液pH值，倒掉上清液；如果pH值小于10，结束碱处理进行下一步处理，否则，重复步骤③。

3.如权利要求2所述的富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酸处理具体如下：

④向经所述碱处理后的装有柱料的离心管加入50毫升0.5摩尔/升盐酸，晃动进行混合，浸泡5分钟；

⑤将所述离心管放入离心机在1000g离心1分钟，倒掉上清液；

⑥向所述离心管加入50毫升超纯水，悬浮柱料，放入离心机在1000g离心1分钟后测量上清液pH值，倒掉上清液；如果pH值大于4，结束酸处理进行下一步处理，否则重复步骤⑥。

4.如权利要求1～3中任一项所述的富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述静置的时间为30分钟。

5.如权利要求1～3中任一项所述的富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述孵育的时间为30分钟。

6.如权利要求1～3中任一项所述的富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述孵育的时间为20分钟。