[发明专利]一种循环肿瘤DNA检测方法，探针及传感器

说明书

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种循环肿瘤DNA检测探针，包括：金纳米粒子‑适配体复合物及包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白‑抗体复合物。本发明提供一种循环肿瘤DNA检测方案，实现高灵敏度，低成本、简便快捷及特异性的定量检测。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种循环肿瘤DNA检测方法，探针及传感器。

背景技术

肿瘤是严重危害人类生命健康的一类慢性疾病，随着肿瘤分子生物学的发展，临床上已达到对肿瘤进行基因水平上的诊断及靶向治疗。循环肿瘤DNA(Circulating tumorDNA，ctDNA)是一种新型的肿瘤生物标志物，它是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA。近年来不断有报道，尽管ctDNA在健康人的血液中含量极低，但当机体处于特殊疾病状态(如肿瘤、炎症疾病和组织创伤等)时，其含量明显上升，且在肿瘤患者中游离DNA还存在DNA完整性、基因突变、DNA超甲基化及染色体基因重排等肿瘤特异性的改变，由于检测血液样本具有容易获取、快速简便且无创伤等优点，因此，检测肿瘤患者血中ctDNA可视为一种“液体活检”。

现有的ctDNA的新检测方法不断出现，即便它们各具检测优势，但仍存在一系列问题，如：检测耗时长、灵敏度及选择性低，只能检测已知突变位点，通量低等。由于ctDNA呈高度碎片状，在外周血中的浓度低、易降解，使这一标准化程序的建立十分困难。

发明内容

本发明提供一种循环肿瘤DNA检测方法，探针及传感器，解决现有技术中循环肿瘤DNA检测灵敏度低，特异性差，耗时长，操作复杂的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种循环肿瘤DNA检测探针，包括：金纳米粒子-适配体复合物及包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物。

一种循环肿瘤DNA检测传感器，包括：丝网印刷电极以及设置在其上的金纳米粒子-适配体复合物与包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物。

进一步地，所述金纳米粒子-适配体复合物的制备方法包括：

按照2∶1的体积比，依次将金纳米粒子AuNPs和适配体Aptamer混合均匀，室温避光静置；

加入等量的PBS溶液，室温避光静置；

加入NaCl溶液，使溶液中NaCl的浓度调节至0.05M，随后室温静中将NaCl的浓度调节至0.1M；

在12,000rpm条件下离心30min，弃去上层清液，用0.1M的NaCl和PBS缓冲液润洗下层固体，储存在0.02％(v/v)Tween 20水溶液中。

进一步地，包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物的制备方法包括：

将包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白加入至含有EDC和NHS的MES缓冲溶液中并超声30分钟；

所得混合溶液以不低于10000rpm离心5分钟，弃去上层清液；

向离心后得到的沉淀中加入5-甲基胞嘧啶单克隆抗体(1mg/mL)，室温下孵化3小时；

混合液在10,000rpm条件下离心10min，弃去上层清液，用PBS润洗下层固体，用PBS缓冲溶液储存4℃冰箱中备用。

一种循环肿瘤DNA检测方法，包括：

将待检样本与金纳米粒子-适配体复合物Aptamer-AuNPs混合；

再将包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白-抗体复合物mAb-LPA加入到上述混合物中；

用微分脉冲伏安法进行电化学检测，在扫速为50mV/s，电位扫描范围-0.9～-0.3V条件下检测包裹了磷酸铅的去铁铁蛋白LPA的信号，测定样品中ctDNA(PIK3CA-E542K)的含量。