[发明专利]微载体上的多能干细胞培养

说明书

本申请是申请日为2009年11月19日，申请号为200980155382.2(PCT/US2009/065062)，发明名称为“微载体上的多能干细胞培养”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明要求于2008年11月20日提交的序列号为61/116,447的专利申请的优先权。

技术领域

本发明涉及用于在微载体上生长、扩增和分化多能干细胞的方法。

背景技术

多能干细胞例如胚胎干细胞具有分化成所有成人细胞类型的能力。因此，胚胎干细胞对于已因疾病、感染或者先天异常而受损的器官来说可能是替代细胞和组织的来源。使胚胎干细胞体外增殖同时保持其多能性的困难限制了胚胎干细胞用作替代细胞来源的潜能。

目前用于培养未分化胚胎干细胞的方法需要复杂的培养条件，例如，在存在饲养细胞层的情况下培养胚胎干细胞。或者，可将通过接触饲养细胞培养物而获得的培养基用来培养胚胎干细胞。采用这些方法的培养体系通常利用得自与所培养干细胞的种类不同的种类的细胞(异种细胞)。或者，这些培养体系可补充有动物血清。

胚胎干细胞为研究和药物筛选提供了潜在来源。目前，人胚胎干细胞系的大规模培养是困难的，并且带来了严峻挑战。目前增殖多能干细胞的体外方法是在培养瓶中在用细胞外基质(ECM)蛋白或饲养细胞预涂覆的平坦表面上进行的。因为其有限的表面积不能支持多能干细胞长期生长，所以平面培养物也需要频繁继代培养。基于微载体的多能干细胞培养方法可提供一种解决方案。微载体具有高的表面积体积比，因此消除了在平坦表面上培养多能干细胞的表面积限制。

例如，Fok等人公开了用于增殖未分化ESC的搅拌悬浮液培养体系微载体和聚集体培养(Stem Cells 2005；23:1333–1342)。

又如，Abranches等人公开了在旋转瓶中测试Cytodex(GE Healthcare Life Sciences,NJ)(一种由葡聚糖基质制成的微孔微载体，在表面上具有胶原层)支持小鼠S25ES细胞系扩增的能力(Biotechnol.Bioeng.96(2007),第1211–1221页)。

又如，US20070264713公开了一种用于在悬浮液中培养未分化干细胞的方法，特别是一种用于在容器中的微载体上培养干细胞的方法。

又如，WO2006137787公开了一种筛选工具，其包括附接到固相载体(如微量滴定板)的颗粒物质或微载体(如小珠)，用于在所述微载体上培养细胞。

又如，WO2008004990公开了一种促进培养物中干细胞的附着、存活和/或增殖的方法，该方法包括在带正电的支持表面上培养干细胞。

又如，WO2007012144公开了一种生物反应器，其包括：支持表面；以及结合至该支持表面的合成连接多肽，其中该合成连接多肽的特征在于对胚胎干细胞或多能细胞的高度结合亲和力。

发明内容

本发明提供用于多能干细胞在微载体上生长、扩增和分化的方法。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于多能干细胞增殖的方法，包括如下步骤：

a.使多能干细胞的群体附着至第一体积的微载体，

b.在第一体积的微载体上培养多能干细胞，

c.将多能干细胞从第一体积的微载体移出，以及

d.使多能干细胞的群体附着至第二体积的微载体。

附图说明

图1：Rho激酶抑制剂促进人胚胎干细胞在微载体上的附着和生长。在II微载体(Solohill,MI)上在静置培养物中生长2天的H9细胞的图像。在有或没有10μM Rho激酶抑制剂Y27632((Sigma-Aldrich,MO)分别为A和B)的情况下，在小鼠胚胎成纤维细胞调理培养基(MEF-CM)中培养细胞。

图2：在微载体上生长的H9细胞。让H9细胞附着至多种微载体，并放置在37℃的摇床上。使用Plastic微载体、ProNectinF微载体、II微载体(Solohill,MI)和Plastic Plus微载体(分别为A、B、C、D)。3天后的生长显示II(Solohill,MI)上的细胞具有与微载体的最佳细胞附着。箭头标示在没有附着至微载体的情况下形成聚集体的细胞。