[发明专利]一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法

说明书

本发明公开了一种组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法，属于酶的固化领域。所述组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒包括交联β‑葡萄糖苷酶聚集体核心和交联的高分子聚合物外壳；所述制备方法是通过交联‑包埋组合式固定化方法，首先在油包水乳化体系中制备了颗粒大小均匀的交联酶聚集体，然后对交联酶聚集体表面进行化学修饰引入碳碳双键基团，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基原位聚合反应得到了该组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒。本发明不仅操作简单、成本低廉、酶活回收率高、酶的稳定性强，而且方便回收重复利用，具有较广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于酶的固定化技术领域，涉及一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法。

背景技术

β-葡萄糖苷酶是广泛存在于自然界中的一类水解酶，它能够水解糖苷和寡糖中非还原性末端的β-糖苷残基从而释放葡萄糖和相应的配基。另外，β-葡萄糖苷酶可催化逆水解反应和转糖基反应，并合成相应的糖苷类化合物。随着糖苷类化合物在医药、食品、日用化工工业上有着重要的应用和经济价值，以及与化学法相比酶法合成糖苷具有高选择性、条件温和、反应过程简单以及环保等众多优点。因此，利用β-葡萄糖苷酶催化各类糖苷的合成和应用受到越来越多的关注。但是β-葡萄糖苷酶催化各类糖苷的合成反应大多数需要在非水相体系和较高温度环境中进行，然而，天然β-葡萄糖苷酶的稳定性较差、易失活，导致催化效率低，限制了其工业化应用，因而增强β-葡萄糖苷酶的稳定性是当前急需解决的问题。

交联酶聚集体是近些年发展起来的一种无载体固定化酶技术。它的制备通常分为沉淀和交联两步，首先利用蛋白沉淀剂(如中性盐、水溶性有机溶剂、非离子型高聚物等)将溶解状态的酶进行物理沉淀得到酶沉淀聚集体，随后利用交联剂(例如戊二醛)与酶聚集体分子上的氨基发生反应，从而得到不溶性固定化酶颗粒。该方法获得的固定化酶制备过程简单、酶活保留率高、具有良好的稳定性和重复操作性，但是多次重复利用后聚集体表面结构容易被破坏而造成酶活损失，在非水相催化过程中酶的稳定性也不够。酶的包埋技术是借助化学或者物理的方法将酶固定在某种载体中的过程，载体的形成可以通过化学的方法(如交联、聚合)、物理的方法(物理的凝胶化)或这两种方法的结合。酶分子可以通过聚合物形成的凝胶载体而被包埋于其中，从而获得固定化酶。该方法制备过程简单、酶活保留率高，但是该方法固定的酶往往稳定性不够而且酶容易渗漏、重复回收利用率低。

单一的固定化方法常常存在一些缺陷，如上述交联聚集体在非水相催化过程中稳定性不够，包埋法中易发生酶的泄漏和难以回收等。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法，通过交联-包埋组合式固定化方法制备出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。本发明首先在油包水乳化体系中制备出颗粒大小均匀的交联酶聚集体，然后对交联酶聚集体表面进行化学修饰引入碳碳双键基团，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基原位聚合制备出一种回收率高且稳定性强的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：本发明提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，包括核心与外壳，所述核心为交联β-葡萄糖苷酶聚集体，所述外壳为交联的高分子聚合物，所述核心位于外壳内部,所述核心与外壳之间通过化学键链接。

本发明还提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将沉淀剂加入到蛋白浓度为10～50g/L的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡搅拌得到混合液；

(2)向步骤(1)所得混合液中依次加入油相和乳化剂，磁力搅拌乳化1～3min，形成油包水体系后，在4～25℃下沉淀反应0.5～1h；

(3)向步骤(2)所得产物中加入交联剂，磁力搅拌乳化1～3min，在4～25℃下交联反应1～3h，将反应得到的产物在5000r/min转速下离心10～15min，收集沉淀，用去离子水重复清洗2～3次，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体；