[发明专利]一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法

权利要求书

1.一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：包括核心与外壳，所述核心为交联β-葡萄糖苷酶聚集体，所述外壳为交联的高分子聚合物，所述核心位于外壳内部,所述核心与所述外壳之间通过化学键链接；固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括以下步骤：（1）将沉淀剂加入到蛋白浓度为10～50g/L的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡搅拌得到混合液；

（2）向步骤（1）所得混合液中依次加入油相和乳化剂，磁力搅拌乳化1～3min，形成油包水体系后，在4～25℃下沉淀反应0.5～1h；

（3）向步骤（2）所得产物中加入交联剂，磁力搅拌乳化1～3min，在4～25℃下交联反应1～3h，将反应得到的产物离心，洗涤，过滤，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体；

（4）将步骤（3）得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体和能与β-葡萄糖苷酶表面氨基发生反应的且含有碳碳不饱和双键的酶修饰剂依次加入到pH值为4.0～7.0的缓冲溶液中，振荡搅拌，形成聚集体悬液，在4～25℃下反应0.5～6h后，置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析12～24h；

（5）向步骤（4）透析后的反应液中依次加入乙烯基单体和引发剂，在4～25℃下反应3～10h后，置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析12～24h，离心收集沉淀，冷冻干燥，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。

2.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（1）中沉淀剂为(NH₄)₂SO₄、PEG400、PEG1000、PEG6000、PEG8000中的一种；所述(NH₄)₂SO₄的加入量为30～80％w/v，所述PEG400、PEG1000、PEG6000、PEG8000的加入量分别为10～30％w/v。

3.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（2）中油相为大豆油、橄榄油、花生油、液体石蜡、菜籽油、色拉油、蓖麻油、丁酸乙酯、辛癸酸甘油酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、油酸聚乙二醇甘油酯中的一种；所述步骤(2)中的油相与步骤(1)制备出的混合液的体积比为5～50:1。

4.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（2）中的乳化剂为Tween60、Tween80、span40、span60、span80、AOT、SDS中的一种；所述乳化剂的加入量为0.2～3％w/v。

5.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（3）中交联剂为戊二醛或葡聚糖聚醛；所述交联剂的加入量为0.5～5％v/v。

6.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（4）中酶修饰剂为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与二甲基亚砜组成的混合物A、丙烯酰氯与二甲基亚砜组成的混合物B、甲基丙烯酸缩水甘油酯与二甲基亚砜组成的混合物C中的一种或几种，所述酶修饰剂的加入量为0.2～1％w/v。

7.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（4）中缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中的一种。

8.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（5）中乙烯基单体为丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基炳烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、N-异丙基丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、顺丁二烯中的一种或几种，所述乙烯基单体的加入量为2～5％w/v。

9.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（5）中引发剂为a和b组成的混合物，所述a为过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化氢、过氧化苯二甲酰中的一种或几种，所述b为N,N'-二甲基苯胺、氨水、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、N-甲基吗啉和哌啶中的一种或几种。