[发明专利]一种检测人EGFR基因突变的液相芯片

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种EGFR基因突变检测基因芯片。

背景技术

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor,表皮生长因子受体简称为EGFR、ErbB-1或HER1）是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗最重要的分子靶点，是原癌基因C-erbB-1（HER-1)的表达产物，位于第7号染色体短臂上。

EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。

研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。其可能机制有：EGFR的高表达引起下游信号传导的增强；突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；自分泌环的作用增强；受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活化后降解减少有关，一些研究指出C-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在，现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可能包括：具有配体非依赖型受体的细胞持续活化；由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体下调机制的破坏、异常信号传导通路的激活、细胞凋亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖，他们的共表达往往预示肿瘤预后不良，例如，在乳腺浸润性导管癌的研究中发现，TGFα与EGFR共表达，且这种共表达与病人的生存率显著相关。Kopp等人对结/直肠癌的研究表明肿瘤的自分泌生长是EGFR的过表达及其配体表达共同作用的结果。

EGFR信号通路重要靶标的检测及靶向治疗已是肿瘤个体化医疗领域关注的焦点，目前已经开发多种EGFR靶向药物。按照作用机制，针对EGFR的靶向药物分为以下两种：1）作用于EGFR激酶区的小分子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）；2）作用于EGFR胞外部分的单克隆抗体，如西妥昔单抗（Cetuximab）、帕尼单抗（Vectibix）。其中EGFR-TKI在治疗非小细胞肺癌（NSCLC）临床疗效明显，已被推荐为晚期癌症患者的一线用药。

临床上，易瑞沙（吉非替尼，Gefitinib）和特罗凯（厄洛替尼，Erlotinib）目前被广泛的应用到NSCLC患者的治疗，单并不是所有的病人用这两种药物就有很好的治疗效果，EFGR敏感突变是药物有效的前提。酪氨酸酶抑制剂与EGFR结合后，抑制EGFR自身磷酸化，阻断了EGFR信号通路,从而抑制肿瘤细胞增殖、分化、促进肿瘤细胞凋亡、减少肿瘤新生血管等，从而实现靶向治疗。

目前，临床上对EGFR基因突变检测的方法主要有Sanger测序法、高效液相色谱法、实时荧光定量法、x-TAG基因芯片法、FISH原位杂交法。在检测时间和灵敏度方面都不太乐观，x-TAG基因芯片法为例，最少需要5个小时才能完成从样本的处理、目的片段的扩增、芯片的杂交、样本的检测；荧光PCR检测时间虽短，但难以从1个反应管内完成29种突变检测。

Barcode Beads技术是把条形芯片磁珠刻上条形编码，共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体。应用时，先把针对不同检测物的条码磁珠混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内可以同时完成多达数十种甚至几百种不同的生物学反应。最后用Applied Barcode 2000仪器进行分析，仪器通过高分辨显微镜和荧光显微镜识别条码磁珠和检测条码磁珠上报告分子的荧光强度实现对样本的检测。