[发明专利]一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种淋巴细胞的培养方法，特别涉及利用自体血清及相关细胞因子构建CD3+CD56+细胞和CD16+CD56+细胞扩增的共同优势环境，获得具高纯度、高杀伤肿瘤细胞能力的细胞亚群(CD3+CD56+&CD16+CD56+)的培养方法。

背景技术

经典CIK细胞培养体系所制取的细胞能将在血液中占比1％～5％CD3+T淋巴细胞进行扩增，而所扩增的细胞除5％至20％的CIK细胞外，多为对肿瘤细胞无显著杀伤能力的辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+)或抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+)。如何获得更多的对肿瘤细胞具高杀伤能力的淋巴细胞亚群是当前的研究热点之一。

活化后的NK细胞可产生细胞因子IFN-γ，IFN-γ在对CIK细胞杀伤性的(CD3+CD56+占比)影响中起关键作用；自体血清内存在IL-2、IL-12、IL-15、IL-18等因子可促使NK细胞活化。

发明内容

针对上述现有技术，为了弥补经典CIK细胞培养中除CD3+CD56+阳性细胞外的，杀伤肿瘤细胞亚群含量低的不足，本发明提供了一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法。本发明利用自体血清及相关因子构建CD3+CD56+和CD16+CD56+细胞扩增共同优势环境，提供了一种步骤简单、操作稳定的体外扩增培养单个核细胞、获得具有高杀伤肿瘤细胞亚群(CD3+CD56+&CD16+CD56+)的培养方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，包括以下步骤：

(1)从脐血或成人外周血中分离出单个核细胞，进行体外培养；同时，分离出的血浆用于制备自体血清添加物；

优选的，采用淋巴细胞无血清培养基KBM581(该培养基是现有技术中已有的商品化培养基，可常规市场购买得到)进行体外培养；

(2)对体外培养的单个核细胞进行细胞因子活化刺激：向含单个核细胞的培养物中加入终浓度为1000IU/ml的INF-γ；再添加培养物总体积5％(体积百分数)的自体血清添加物，37℃、5.0％CO₂条件下培养；24小时后，加入OKT3抗体、IL-2和IL-1a，OKT3抗体终浓度为50ng/ml，IL-2终浓度为1000IU/ml，IL-1a终浓度为100IU/mL，37℃、5.0％CO₂条件下继续培养；

所述自体血清添加物，是通过以下方法制备得到的：将步骤(1)中分离出的血浆，于56℃环境下静置30min，然后于-20℃环境下静置10min；3000rpm离心10min，收集血清，添加IL-12至终浓度为1000pg/ml，即得自体血清添加物；

(3)培养3天后，观察细胞增殖情况，细胞活化过程形成典型的细胞团，根据细胞的生长情况，进行补液操作，使细胞生长密度保持在1×10⁶～2×10⁶/ml；培养14天后，获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群，检测细胞表型。

进一步地，所述步骤(1)的具体操作如下：

①将采血袋或采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，抽取采血袋或采血管中的脐血或成人外周血，分装到50ml离心管中，每管血液30ml，800g下离心10min；

②离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中，吸至距分界面0.5cm处为止，若剩余血细胞多于15ml，则取上层15ml血细胞置于新的离心管中，弃去底部剩余红细胞；

③用生理盐水按照1∶1的比例稀释血细胞，取装有15mlficoll的离心管并倾斜，缓慢的将混匀的血细胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，血样与ficoll的比例不超过2∶1，于常温低升降速(离心机有升速和降速，低升降速指升降速小)，500g下离心20min；

④离心后液面分为4层，从底部分别为红细胞、ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，500g下离心10min；

⑤离心后弃上清，细胞沉淀先用10ml生理盐水重悬，再加生理盐水至40ml，混匀，取样用于细胞数量检测、细胞亚群含量检测，500g下离心10min；