[发明专利]一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法

权利要求书

1.一种获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)从脐血或成人外周血中分离出单个核细胞，进行体外培养；同时，分离出的血浆用于制备自体血清添加物；

(2)对体外培养的单个核细胞进行细胞因子活化刺激：向含单个核细胞的培养物中加入终浓度为1000IU/ml的INF-γ；再添加培养物总体积5％的自体血清添加物，37℃、5.0％CO₂条件下培养；24小时后，加入OKT3抗体、IL-2和IL-1a，OKT3抗体终浓度为50ng/ml，IL-2终浓度为1000IU/ml，IL-1a终浓度为100IU/mL，37℃、5.0％CO₂条件下继续培养；

所述自体血清添加物，是通过以下方法制备得到的：将步骤(1)中分离出的血浆，于56℃环境下静置30min，然后于-20℃环境下静置10min；3000rpm离心10min，收集血清，添加IL-12至终浓度为1000pg/ml，即得自体血清添加物；

(3)培养3天后，根据细胞的生长情况，进行补液操作，使细胞生长密度保持在1×10⁶～2×10⁶/ml；培养14天后，获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群。

2.根据权利要求1所述的获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采用淋巴细胞无血清培养基KBM581进行体外培养。

3.根据权利要求1所述的获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体操作如下：

①将采血袋或采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，抽取采血袋或采血管中的脐血或成人外周血，分装到50ml离心管中，每管血液30ml，800g下离心10min；

②离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中，吸至距分界面0.5cm处为止，若剩余血细胞多于15ml，则取上层15ml血细胞置于新的离心管中，弃去底部剩余红细胞；

③用生理盐水按照1∶1的比例稀释血细胞，取装有15ml ficoll的离心管并倾斜，缓慢的将混匀的血细胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，血样与ficoll的比例不超过2∶1，于常温低升降速，500g下离心20min；

④离心后液面分为4层，从底部分别为红细胞、ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，500g下离心10min；

⑤离心后弃上清，细胞沉淀先用10ml生理盐水重悬，再加生理盐水至40ml，混匀，取样用于细胞数量检测、细胞亚群含量检测，500g下离心10min；

⑥离心后弃上清，用淋巴细胞无血清培养基KBM581将细胞密度调整为1×10⁶～2×10⁶/ml，加入到培养瓶中，37℃、5.0％CO₂浓度培养箱中培养。

4.根据权利要求1所述的获得具高杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞亚群的方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体操作如下：

培养第4天，添加50ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物；所述扩增用培养基为含浓度为1000IU/ml IL-2的KBM581培养基；

培养第5天，添加100ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物；

培养第6天，添加200ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物；

培养第8天，添加400ml扩增用培养基，不再添加血清添加物；

培养第10天，添加800ml扩增用培养基；

培养第12天，添加400ml扩增用培养基；

培养第14天，收获细胞。