[发明专利]一种母乳酸性寡糖净化和分析方法

说明书

本发明涉及一种母乳酸性寡糖的净化与分析方法。其特征是：样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，再经在线的净化柱去除乳糖及中性寡糖干扰，获得的酸性糖经亲水作用色谱柱分离，蒸发光、电喷雾、紫外或质谱检测，得到母乳酸性糖结构、组成和含量信息。该方法具有选择性好，稳定性好，操作简便可控，通量高等特点，适用于哺乳动物乳和人乳样品的快速、高通量分析。

技术领域

本发明涉及一种母乳酸性寡糖净化和分析方法。其特征是：样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白，静电排斥模式的柱色谱净化酸性寡糖，去除乳糖及中性寡糖干扰，再经在线HILIC柱分离分析，蒸发光、电喷雾、紫外或质谱检测，获得结构组成分析。该方法具有选择性好，稳定性好，操作简便可控，通量高等特点，适用于大量母乳样品的快速分析。

技术背景

寡糖是母乳中重要组成成分，具有重要的生理功能。对婴儿的正常生长发育起着至关重要的作用，如抗炎、抗感染、免疫调控和维持肠道菌群平衡。寡糖包括酸性寡糖和中性寡糖，酸性寡糖是常被唾液酸化的寡糖，含量较中性寡糖低，但在体内起着不可替代的作用，如预防癌症发生、促进婴儿脑的正常发育等功能。在不同的人及动物乳中，酸性寡糖的种类和含量有一定的差异。

深入了解母乳中酸性寡糖生物和药理活性的前提是对人和动物乳中酸性寡糖进行组成、结构和含量分析，因此，发展一种简单、快速、高通量的酸性寡糖的分析方法具有重要的意义。然而，由于酸性寡糖在母乳寡糖中含量低，在分析时乳糖及中性寡糖干扰严重，结构种类众多，从而增加了分析的难度。近年来，对母乳酸性寡糖分析的研究备受关注。

目前，对母乳酸性寡糖净化方法主要有2种：(1)采用离线方法，先用凝胶渗透除去大量的乳糖，在采用离子交换色谱，除去大量的中性寡糖，净化的酸性寡糖进一步脱盐后分析。(2)采用离线的PGC SPE柱，除去大量的乳糖及中性寡糖，得到酸性寡糖馏分。然而，上述2种方法的选择性较低，繁琐耗时。通过在线SPE柱色谱净化和分析方法，除去大量的乳糖及中性寡糖干扰，酸性寡糖馏分直接进行HILIC柱色谱分析，具有选择性高，重复性好，通量高的特点，用于酸性寡糖profiling方法的研究具有一定的优势。因此，本发明设计出一种新的母乳酸性寡糖净化及分析方法，用于大规模母乳酸性寡糖的快速分析。

发明内容

本发明涉及一种母乳酸性寡糖净化及分析方法。本发明特征在于：样品经过低温离心脱脂、有机溶剂沉淀除蛋白、柱色谱除乳糖及中性寡糖，净化的酸性寡糖直接采用在线HILIC柱分离，蒸发光、电喷雾、紫外或质谱检测，获得结构、组成和含量分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种母乳酸性寡糖净化及分析方法，样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，经柱色谱净化酸性寡糖，收集酸性寡糖馏分窗口，继续采用在线HILIC柱分析酸性寡糖。流动相为有机溶剂和水或有机溶剂和缓冲盐水溶液，通过优化色谱参数，使用等度或梯度洗脱条件。

1.所述离心脱脂步骤为：取母乳样品，于0-10℃条件下，500-50000g，优选2000-5000g，离心1-500分钟，优选5-30分钟，除去上层脂质。离心1-5次后，取下层既得脱脂母乳样品。

2.所述沉淀除蛋白步骤为：取脱脂母乳样品，加入1-5倍体积量的有机溶剂混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃500-50000g，优选2000-5000g，离心1-500分钟，优选5-30分钟，收集上层液，离心1-5次，合并上层液，得到脱脂除蛋白样品溶液或冻干得到的固体。所使用的有机溶剂有甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或两种以上。

3.所述柱色谱净化酸性寡糖的固定相及HILIC柱固定相为极性色谱填料，包括硅胶或极性键合硅胶填料，其结构式如下：