[发明专利]一种母乳酸性寡糖净化和分析方法

权利要求书

1.一种母乳酸性寡糖净化及分析方法，其特征是：母乳样品经过离心脱脂、沉淀除蛋白，SPE净化柱除乳糖及中性寡糖，获得酸性寡糖馏分，直接在线进入亲水作用色谱HILIC柱分析，质谱检测，获得结构组分分析；

SPE净化柱填料为硅胶或硅胶表面键合极性基团的填料，所键合的极性基团有两性氨基酸、磺酰基、羧基和两性离子中的一种或两种以上；

HILIC分析柱填料为硅胶表面键合极性基团的材料，所键合的极性基团包括氨基酸、氨基、酰胺基、两性离子、季铵基基团的一种或两种以上；

A、当SPE净化柱填料为硅胶表面键合谷胱甘肽、天冬氨酸基团的一种或两种的材料时，SPE净化柱净化酸性寡糖步骤采用的流动相为有机溶剂和水，HILIC柱填料则为硅胶表面键合的酰胺、氨基基团的一种或两种材料，亲水作用色谱分析酸性寡糖流出液步骤采用的流动相为缓冲盐水溶液pH 2-6和有机溶剂；

或B、当SPE净化柱填料为硅胶表面键合谷胱甘肽、天冬氨酸基团的一种或两种的材料时，SPE净化柱净化酸性寡糖步骤采用的流动相为有机溶剂和水，HILIC柱填料为硅胶表面键合的赖氨酸、精氨酸、组氨酸的一种或两种以上基团材料，亲水作用色谱分析酸性寡糖流出液步骤采用的流动相为缓冲盐水溶液pH 2-10和有机溶剂；

或C、当SPE净化柱填料为硅胶材料时，SPE净化柱净化酸性寡糖步骤采用的流动相为有机溶剂和水，HILIC柱填料则为硅胶表面键合的氨基、酰胺的一种或两种基团材料，亲水作用色谱分析酸性寡糖流出液步骤采用的流动相为缓冲盐水溶液pH 2-6和有机溶剂；

或D、当SPE净化柱填料为硅胶材料时，SPE净化柱净化酸性寡糖步骤采用的流动相为有机溶剂和水，HILIC柱填料则为硅胶表面键合的赖氨酸、精氨酸或组氨酸的一种或两种以上基团材料，亲水作用色谱分析酸性寡糖流出液步骤采用的流动相为缓冲盐水溶液pH 2-10和有机溶剂；

或E、当SPE净化柱填料为硅胶表面键合半胱氨酸基团的材料时，SPE净化柱净化酸性寡糖步骤采用的流动相为有机溶剂和缓冲盐溶液pH6-10，HILIC柱填料则为硅胶表面键合的季铵基、赖氨酸、精氨酸或组氨酸的一种或两种以上基团材料，亲水作用色谱分析酸性寡糖流出液步骤采用的流动相为缓冲盐水溶液pH 6-10和有机溶剂；

或F、当SPE净化柱填料为硅胶表面键合羧基、磺酰基、磷酸基的一种或两种以上基团的材料时，SPE净化柱净化酸性寡糖步骤采用的流动相为有机溶剂和水，HILIC柱填料则为硅胶表面键合的季铵基团材料，亲水作用色谱分析酸性寡糖流出液步骤采用的流动相为缓冲盐水溶液pH 6-10和有机溶剂；

SPE净化柱净化酸性寡糖步骤为：取脱脂除蛋白母乳固体样品，用样品溶解液溶解样品，或直接取脱脂除蛋白母乳液体样品，通过自动进样器进入SPE净化柱中，以具有静电排斥作用的亲水材料为色谱柱固定相，流动相为水和有机溶剂、或缓冲盐水溶液和有机溶剂，使用等度或梯度方法进行洗脱，酸性寡糖馏分直接在线进入串联的分析柱分析；

亲水作用色谱分析酸性寡糖流出液的步骤为：酸性寡糖流出液直接在线通入HILIC柱，被捕集到HILIC柱，再进行分离分析，流动相为水和有机溶剂、或缓冲盐水溶液和有机溶剂，使用等度或梯度方法进行洗脱，检测；

所述样品溶解液为有机溶剂甲醇、乙腈、乙醇、丙酮中的一种或两种以上和水混合溶液的体积比例为50-70%；洗脱液中的有机溶剂有：甲醇，乙腈，乙醇，异丙醇，丙酮中的一种或两种以上；

洗脱液中所选择缓冲盐类型及其于流动相中的浓度如下：

a)甲酸铵缓冲盐，浓度1-200 mM；

b)乙酸铵缓冲盐，浓度1-200 mM；

c)碳酸氢铵缓冲盐，浓度1-200 mM；

SPE净化柱净化酸性寡糖及亲水色谱柱分析酸性寡糖步骤中，流动相水和有机溶剂、或缓冲盐水溶液和有机溶剂作为洗脱液的体积比例为5/95~95/5；

SPE净化柱净化酸性寡糖步骤中，色谱柱内径为2.1-10 mm，填料粒径为1-40μm；分析方法的流速为0.1-2 BV/min；酸性寡糖馏分收集窗口为0-10 BV，收集流出液；

优化色谱操作参数，包括流速、柱温和检测器，及阀切换时间，具体操作如下：

a)流速为0.1-2 BV/min；

b)柱温为15-60 ℃；

c)检测器为质谱；

d)阀切换时间0-10 BV。