[发明专利]一种基于流式细胞术检测血小板受体GPIba胞外段酶切的方法

说明书

本发明公开了一种基于流式细胞术检测血小板受体GPIba胞外段酶切的方法，其具体步骤为：(1)样本准备和处理；(2)流式细胞仪检测；(3)Weasel软件数据分析。本发明通过使用两种不同荧光标记的抗体，分别为抗GPIba胞外段抗体和抗GPIba胞内段抗体，通过流式细胞术分析胞外段抗体与胞内段抗体的结合的相对值，即可反映出GPIba胞外段酶切的程度。本发明的检测方法不依赖于血小板数目的变化，适用于血小板数目减少的情况，且可靠性高，稳定性好。

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，具体涉及一种基于流式细胞术检测血小板受体GPIba胞外段酶切的方法。

背景技术

GPIb-IX-V复合物由GPIba、GPIbb、GPIX和GPV构成(图1)。GPIba与GPIbb通过二硫键结合，再通过非共价键与GPIX和GPV连接。GPIba是GPIb-IX-V复合物中的主要配体结合亚基，由626个氨基酸残基组成。GPIba是一种膜表达分子，由胞外段、跨膜区和胞内段组成。作为血小板最重要的粘附分子，GPIba通过与相应配体结合发挥多种生物学功能。

在血小板活化或者受到某种刺激后，GPIba胞外段将会发生酶切，具体主要是由金属蛋白酶ADAM17所介导，切割GPIba胞外段，释放出可溶性片段(也叫糖萼素，Glycocalicin)，同时留下与细胞膜所结合的胞内段(图2)。GPIba酶切参与调控血小板多种生物学功能：如下调血小板GPIba的功能、参与血小板体内的清除等。因此通过检测GPIba的胞外段酶切，可以间接反映出血小板的功能。

目前关于检测GPIba胞外段酶切的方法有两种，一种是蛋白免疫印迹(Westernblot)检测；另外一种是酶联免疫吸附(ELISA)检测。但是Western blot检测需要一定量的细胞数目来获得检测所需的蛋白量，故在血小板减少的情况下，此方法不适合检测GPIba胞外段酶切。此外，GPIba胞外段酶切是持续发生的(即使在静息状态下)，这样就会导致血浆、血清或者血小板上清中的可溶性片段水平很高，造成ELISA的背景值偏高。通过ELISA方法检测GPIba胞外段酶切，会降低检测结果的可靠性和稳定性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于流式细胞术检测血小板受体GPIba胞外段酶切的方法，该方法适用于血小板数目减少的情况，且可靠性高。

为实现上述目的，本发明的一种基于流式细胞术检测血小板受体GPIba胞外段酶切的方法，包括以下步骤：

(1)样本准备和处理

a.收集人5ml静脉血，采集到含抗凝剂枸橼酸三钠水溶液的试管中，抗凝剂枸橼酸三钠水溶液与静脉血按1：9体积比例缓慢混匀；

b.室温下，120×g离心20分钟，吸取上层富含血小板血浆(PRP)；

c.将吸取到的PRP分别加入到5个EP管中，每个EP管中含血小板数目为1×10⁷个，补充含5mmol EDTA的1×TS缓冲液至100μl；5个EP管分别为：同型对照1(PE荧光标记)、同型对照2(Alexa荧光标记)、PE-AK2(胞外段抗体PE荧光标记)、Alexa-tail(胞内段抗体Alexa荧光标记)和双标记(PE-AK2+Alexa-tail)；

d.在PE-AK2管和双标记管中加入2μg/ml PE标记的抗GPIba胞外段抗体(AK2)，同时在同型对照1管加入同型对照抗体PE-IgG，室温避光孵育30分钟，30分钟后，同型对照1管和PE-AK2管直接进行流式细胞仪检测和分析，其余三管进行Alexa染色；

e.同型对照2管、Alexa-tail管和双标记管中的血小板使用含5mmol EDTA的1×TS缓冲液洗涤，弃上清；使用1％的多聚甲醛(溶解在含5mmol EDTA的1×TS缓冲液中)避光固定10分钟；使用含5mmol EDTA的1×TS缓冲液洗涤；