[发明专利]一种基于流式细胞术检测血小板受体GPIba胞外段酶切的方法

权利要求书

1.一种基于流式细胞术检测血小板受体GPIba胞外段酶切的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样本准备和处理

a.收集人5 ml静脉血，采集到含抗凝剂枸橼酸三钠水溶液的试管中，抗凝剂枸橼酸三钠水溶液与静脉血按1：9体积比例缓慢混匀；

b.室温下，120 × g 离心20分钟，吸取上层富含血小板血浆；

c.将吸取到的富含血小板血浆分别加入到5个EP管中，每个EP管中含血小板数目为1×10⁷个，补充含5 mmol EDTA 的1×TS缓冲液至100 μl；5个EP管分别为：同型对照1、同型对照2、PE-AK2、Alexa-tail和双标记；其中同型对照1是PE荧光标记，同型对照2是Alexa荧光标记，PE-AK2是胞外段抗体PE荧光标记，Alexa-tail是胞内段抗体Alexa荧光标记，双标记是PE-AK2+Alexa-tail；

d.在PE-AK2管和双标记管中加入2 μg/ml PE标记的抗GPIba胞外段抗体AK2，同时在同型对照1管加入同型对照抗体PE-IgG，室温避光孵育30分钟，30分钟后，同型对照1管和PE-AK2管直接进行流式细胞仪检测和分析，其余三管进行Alexa染色；

e.同型对照2管、Alexa-tail管和双标记管中的血小板使用含5 mmol EDTA 的1×TS缓冲液洗涤，弃上清；使用1%溶解在含5 mmol EDTA 的1×TS缓冲液中的多聚甲醛避光固定10分钟；使用含5 mmol EDTA 的1×TS缓冲液洗涤；

f.加入0.1%溶解在含5 mmol EDTA 的1×TS缓冲液中的皂角苷进行破膜，同时在Alexa-tail管和双标记管中加入2 μg/ml Alexa Fluor 488标记的抗GPIba胞内段抗体，同型对照2中加入Alexa Fluor 488标记的同型对照抗体Alexa-IgG，避光孵育30分钟；

g.用含0.1%溶解在含5mmol EDTA 的1×TS缓冲液中的皂角苷洗涤2次；将血小板重悬在500 μl含5mmol EDTA 的1×TS缓冲液中，进行流式细胞仪检测；

（2）流式细胞仪检测

a.使用同型对照1管，通过前向角散射和侧向角散射来鉴别血小板；

b.在鉴别的血小板群周围画一个区域R1，设定收集R1内的1000个事件；

c.通过使用同型对照1管和同型对照2管设定FL1通道和FL2通道的电压值；其中，FL1通道是Alexa Fluor 488荧光通道，FL2通道是PE荧光通道；

d.使用PE-AK2管和Alexa-tail管设定荧光补偿，消除这两种荧光的相互干扰；

e.设置完成后，进行每管数据的收集；

（3）Weasel软件数据分析

a.使用Alexa-tail管的数据，在Alexa和SSC的模式下，画出Alexa-tail阳性区域R0；

b.将双标记的数据展示出来，使双标记的每个事件都来自于R0区域；

c.设定四个象限，通过同型对照1管和同型对照2管，设定PE和Alexa的阳性和阴性区域，即在阳性和阴性交汇点画条垂直的直线；

d.右上象限的数据即代表血小板膜表面多少GPIba保持完整型状态。

2.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测血小板受体GPIba胞外段酶切的方法，其特征在于，所述的枸橼酸三钠水溶液由1.6克枸橼酸三钠溶解于50 ml蒸馏水中制成。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于流式细胞术检测血小板受体GPIba胞外段酶切的方法，其特征在于，所述的1×TS缓冲液的组成为：0.01molTris-HCl, 0.15molNaCl, pH7.4。