[发明专利]一种花粉管尖端超薄切片的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种花粉管尖端超薄切片的方法，包括以下步骤：花粉培养，花粉管固定、洗涤，花粉管样品切割，花粉管尖端的离心、凝固，琼脂凝固花粉管尖端样品块的洗涤，包埋剂配置，浸泡液配置，浸透，包埋、聚合和切片处理，本发明方法其操作简单，可有效的得到花粉管尖端切片，其操作效率高，得到的花粉管尖端切片经过染色观察呈三角形排列，可见明显的线粒体，可表明切割得到的切片为正在生长的花粉管尖端，具有可靠的稳定性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种花粉管尖端超薄切片的方法。

背景技术

自十七世纪，Robert Hooke利用显微镜观察植物木栓细胞以来，数百年的时间，显微镜已经成为研究细胞的细节和现象的强有力的工具。过去常用作记录从细胞简单的行为如细胞质流到复杂的细胞活动，如在细胞周期中细胞骨架动态作用。

然而近十年来，研究人员逐渐远离使用显微镜来研究细胞过程，取而代之的是分子生物学方法，用该方法研究细胞生物学，基因功能和结构。已经花费了大量的精力用于研究模式植物及具有重要经济价值的基因组。我们希望让研究人员重新回到细胞水平上，研究这些基因产物的功能。这样就需要非常精细的细节，然而光学显微镜只能提供有限的分辨率，因此20世纪电子显微镜的发明，揭开了病毒和细胞亚显微结构的奥秘。在20世纪60年代以来，TEM广泛用于工农业生产、材料学、考古学、生物学、组织学、病毒学、病理学和分子生物学等研究领域中。

细胞极性和非对称生长是细胞生长中特殊形式，是真核细胞关键发育过程，如酵母，胚，神经细胞，花粉管，根毛细胞，真菌菌丝及藻类的假根。花粉管是生长速度最快的细胞之一，提供一个非常好的单细胞生长模型，用于研究调节，极性和周期性生长的机理。在观察所有的植物中，花粉管生长都集中在尖端,生长过程中的花粉管尖端含有大量的转运囊泡，细胞内胞吞和胞吐都高度活跃，以满足旺盛快速的细胞膜扩张和细胞壁合成的需要。采用透射电镜观察花粉尖端的超微结构，但是利用透射电镜观察花粉尖端有一个最大难点就是花粉管比较小，在体外培养时，花粉管生长方向极其混乱，在超薄切片时，极难保证切到花粉管尖端。到目前为止，国内外还没有一种方法在超薄切片时可以高效率地获得花粉管尖端切片。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种花粉管尖端超薄切片的方法，其操作简单，可有效的得到花粉管尖端切片，具有可靠的稳定性。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种花粉管尖端超薄切片的方法，包括以下步骤：

A、花粉培养：将花粉加入液体培养基中，每毫升液体培养基中含有花粉1×10⁵个，并在黑暗条件下进行培养，得到萌发的花粉管；

B、花粉管固定、洗涤：将步骤A中得到的萌发的花粉管用浓度为0.025g/ml的戊二醛浸泡进行固定4h，然后用磷酸缓冲液洗涤后，再加入浓度为0.01g/ml的锇酸在4℃条件下浸泡12h，最后用磷酸缓冲液洗涤后，得到花粉管样品；

C、花粉管样品切割：将步骤B中得到的花粉管样品平铺于激光显微切割机专用膜片上，然后把载有花粉管样品的激光显微切割专用膜片置于显微镜下，通过电脑操控系统，对花粉管样品的尖端部位进行切割，并将切割得到的花粉管尖端与专用膜片加入离心管中；激光显微切割机专用膜片，型号是Leica,No.11505188,0.9μm,POL-Membrane，该膜是Leica公司生产专用于激光共聚焦扫描显微镜(LEICA TCS SP5)的切割，该电脑操作系统的软件名为Leica Laser Miicrodissection，点击工具栏中的“Select”，再点击“Draw”，选定花粉管尖端部位进行切割；

D、花粉管尖端的离心、凝固：在步骤C中的离心管中加入浓度为0.01g/ml的低熔点琼脂糖，再将离心管加入高速离心机中进行离心分散后，离心管底部为花粉管尖端，最后琼脂糖凝固，得到琼脂糖凝固花粉管尖端样品，低熔点琼脂糖，低溶点是指在温度40度时，琼脂糖能溶化；