[发明专利]一种花粉管尖端超薄切片的方法

权利要求书

1.一种花粉管尖端超薄切片的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、花粉培养：将花粉加入液体培养基中，每毫升液体培养基中含有花粉1×10⁵个，并在黑暗条件下进行培养，得到萌发的花粉管；

B、花粉管固定、洗涤：将步骤A中得到的萌发的花粉管用浓度为0.025g/ml的戊二醛浸泡进行固定4h，然后用磷酸缓冲液洗涤后，再加入浓度为0.01g/ml的锇酸在4℃条件下浸泡12h，最后用磷酸缓冲液洗涤后，得到花粉管样品；

C、花粉管样品切割：将步骤B中得到的花粉管样品平铺于激光显微切割机专用膜片上，然后把载有花粉管样品的激光显微切割专用膜片置于显微镜下，通过电脑操控系统，对花粉管样品的尖端部位进行切割，并将切割得到的花粉管尖端与专用膜片加入离心管中；

D、花粉管尖端的离心、凝固：在步骤C中的离心管中加入浓度为0.01g/ml的低熔点琼脂糖，再将离心管加入高速离心机中进行离心分散后，离心管底部为花粉管尖端，最后琼脂糖凝固，得到琼脂糖凝固花粉管尖端样品；

E、琼脂凝固花粉管尖端样品块的洗涤：在步骤D中得到的琼脂糖凝固花粉管尖端样品进行切割，得到长宽高为2mm×1mm×1mm的琼脂糖凝固花粉管尖端样品块，再依次加入体积浓度为30％、50％、70％、80％、90％的丙酮中进行脱水，每次10min，再加入100％的丙酮中脱水2次，每次30min，得到脱水后的花粉管尖端样品；

F、包埋剂配置：将Spon812环氧树脂：DDSA：NMA：DMP-30按质量比5:2:3:0.22进行混合，得到包埋剂；

G、浸泡液配置：将体积浓度为100％的丙酮与步骤F中得到的包埋剂依次按照体积比为2:1、1:1、1:2进行混合分别得到第一浸泡液、第二浸泡液与第三浸泡液；

H、浸透：将步骤E中得到的花粉管尖端样品依次加入步骤G中得到的第一浸泡液、第二浸泡液与第三浸泡液中，浸泡液要淹没花粉管尖端样品，分别在4℃温度条件下浸泡2h，最后移除浸泡液再加入Spon812环氧树脂浸泡2h，得到浸透后的花粉管尖端样品；

I、包埋、聚合：在37℃条件下，将Spon812环氧树脂分别加入包埋模具的穴孔中，加入的量正好填满穴孔，再将步骤H中浸透后的花粉管尖端样品分别加入穴孔中，并依次在37℃聚合12h，45℃聚合12h，60℃聚合48h，70℃聚合过夜，得到花粉管尖端树脂聚合物；

J、切片处理：利用锉刀或铁沙皮对步骤I中得到的花粉管尖端树脂聚合物进行打磨，其树脂较厚的一端先用刀片进行切除，再进行打磨，使花粉管尖端暴露出聚合物，使待切部位呈方形，最后用刀片将花粉管尖端树脂聚合物的磨面切平，再通过切片机切割，得到切片厚度为50-70nm的薄切片。

2.根据权利要求1所述一种花粉管尖端超薄切片的方法，其特征在于，在步骤A中，所述液体培养基的配置方法：以双蒸馏水为溶剂，依次加入0.5mmol/LCa(NO₃)₂,1.6mmol/LH₃BO₃,1.6mmol/LMgSO₄,1mmol/LKNO₃,440mmol/L蔗糖混合均匀即可,其pH值控制在6.0

-6.2。

3.根据权利要求1所述一种花粉管尖端超薄切片的方法，其特征在于，在步骤A中，所述培养温度为25℃，培养时间为3h。

4.根据权利要求1所述一种花粉管尖端超薄切片的方法，其特征在于，在步骤B中，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L。

5.根据权利要求1所述一种花粉管尖端超薄切片的方法，其特征在于，在步骤D中，所述高速离心机的转速控制在12000r/min，温度控制在40℃，离心时间控制在20min。