[发明专利]体外重折叠波形蛋白的方法及其应用

说明书

本申请提供了体外重折叠野生型或突变型波形蛋白的方法、通过该方法制备的野生型或突变型波形蛋白的应用，以及鉴定正确重折叠的波形蛋白的方法。

技术领域

本申请大体涉及蛋白质工程领域，更具体而言，本申请涉及波形蛋白的制备方法，特别是体外重折叠波形蛋白的方法及其应用。

背景技术

在类风湿性关节炎病人中已发现，波形蛋白含两个甘氨酸到精氨酸的突变，并且蛋白表面的精氨酸脱氨瓜氨酸化。用体外重组表达的瓜氨酸化突变型波形蛋白(mutantcitrullinated vimentin，MCV)作为抗原来检测血清中抗体含量，是一种新的类风湿性关节炎检测方法，其灵敏度和特异性都比现有的类风湿性关节炎因子和环瓜氨酸肽临床检测方法高。

波形蛋白是细胞骨架中间丝家族成员之一。波形蛋白的完整三维结构迄今未知，虽然在PDB(Protein Data Bank)有多个已报道的波形蛋白片段结构(4YPC、4YV3、3G1E、3S4R、3SSU、3SWK、3TRT、3UF1、3KLT)，但是最大片段也仅覆盖100多个氨基酸。异源表达的人波形蛋白及突变型波形蛋白可溶性差，需要体外变性后进行重折叠。然而，人波形蛋白及突变型波形蛋白的重折叠的体外条件目前报道的方法不明确。例如，已有报道使用层析法，用多组氨酸标记突变型波形蛋白，将其在变性条件下亲和层析结合在镍柱上，再用不含变性剂的含咪唑的缓冲液洗脱。但是，此方法的重复性较差，变性后的突变型波形蛋白无法洗脱，或洗脱后呈沉淀状态，明显未能正确折叠。此外，波形蛋白折叠后的蛋白构型尚无定性标准，折叠后易形成不同分子量大小的中间丝，无法准确定量用于后续的抗体含量检测。

因而，迫切需要建立正确折叠波形蛋白和/或质量控制的方法，以满足简便且低耗地诊断类风湿性关节炎的需求。

发明内容

第一方面，本申请提供体外重折叠野生型或突变型波形蛋白的方法，包括以下步骤：使重组表达获得的野生型或突变型波形蛋白制备物与pH为6-10的包含变性剂和还原剂的缓冲液接触以溶解所述制备物，并获得蛋白溶液；以及在氧化还原混合物存在下，通过透析法阶段式降低蛋白溶液中变性剂的浓度，以重折叠野生型或突变型波形蛋白。

在一些实施方案中，阶段式降低蛋白溶液中变性剂的浓度包括通过透析法将所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中变性剂的浓度阶段性地降低至初始浓度的50％、25％和0％。在一些实施方案中，通过使用包含所述变性剂并且所述变性剂的浓度梯度降低的三种透析液，所述三种透析液中变性剂的浓度分别为所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中变性剂的浓度的50％、25％和0％。

在一些实施方案中，野生型或突变型波形蛋白制备物通过以下步骤获得：使宿主细胞表达野生型或突变型波形蛋白；裂解宿主细胞，获得包涵体形式的野生型或突变型波形蛋白制备物。

在一些实施方案中，变性剂为尿素和/或盐酸胍。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为1～10M。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为4～8M。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为8M。在该具体实施方案中，阶段式降低蛋白溶液中变性剂的浓度可以使用三种透析液依次实施透析，所述三种透析液中尿素和/或盐酸胍的浓度分别为4M、2M和0M。

在一些实施方案中，还原剂为二硫苏糖醇(DTT)或β巯基乙醇。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇或β巯基乙醇的浓度为1～20mM。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇或β巯基乙醇的浓度为5～15mM。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇或β巯基乙醇的浓度为10mM。

在一些实施方案中，氧化还原混合物为还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。在一些实施方案中，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例为1:10。