[发明专利]一种卡那霉素残留荧光免疫层析试纸及其制备方法

说明书

本发明公开了一种卡那霉素残留荧光免疫层析检测试纸及制备方法。包括样品垫，抗体结合垫，NC纤维素膜，吸水纸，自下而上依次通过带有粘合剂的底板互相搭接而成，所述NC纤维素膜上从靠近抗体结合垫一端依次为包被检测线T线和质控线C线。所述抗体结合垫承载荧光标记抗体的结合物，所述NC纤维素膜自上而下分别设有用偶联包被抗原Kana‑BSA喷划的T线和用羊抗鼠二抗IgG喷划的C线，荧光标记探针为稀土荧光二氧化硅纳米颗粒，荧光标记探针以醛基葡聚糖作为交联试剂与抗体结合；利用凝胶成像系统和荧光读卡仪考察荧光免疫层析试纸条的制备条件，利用荧光读卡仪检测T线的荧光强度，通过卡那霉素抗原浓度的标准曲线完成定量检测。

技术领域

本发明涉及一种免疫层析试纸，特别是涉及一种检测卡那霉素的荧光免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

卡那霉素(Kanamycin，简称Kana)，属于氨基糖苷类抗生素中的一种，对常见的致病菌，如大肠杆菌、结核杆菌等革兰氏阴性菌有很强的抑制作用，主要通过与细菌的30S核糖体RNA 相互作用抑制其蛋白质合成而起到杀菌作用。一旦用量不规范，通过食物或药物摄入人体过量，会产生严重的副作用，包括肾毒性、听力丧失、过敏性等。然而由于其价格低廉且抗菌性广，卡那霉素被广泛使用，容易造成其在动物源性食品中的残留，危及人类身体健康，欧盟规定牛奶中卡那霉素的残留量为150μg/L。

目前，用于卡那霉素检测的方法有：ELISA、液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法和微生物检测法。液相色谱-串联质谱法检测灵敏性高，依据国家标准GB/T22969-2008，牛奶中卡那霉素检出限为10μg/kg，但检测程序复杂，费用较高。微生物检测法应用较为广泛，但其测定时间长，且结果误差较大。酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)法利用抗原抗体特异性结合，具有高选择性，但药品昂贵，操作较为复杂，费时，限制了它的使用。因此，建立一种低成本、低消耗、高灵敏、高选择性且适用于食品安全现场快速检测的卡那霉素检测技术是很有必要的。目前，现场快检方法用的较多的是胶体金免疫试纸条法，该方法简便快捷、费用低，但在定量检测和灵敏度方面存在不足。为弥补上述问题，以镧系荧光二氧化硅纳米颗粒为代表的荧光材料作为标记探针的荧光免疫层析技术 (1ateral flow immunoassay，LFIA)近些年来得到广泛发展，该方法能有效消除检测背景强度，大大提高了检测灵敏度，增强了方法选择性，可实现定量及多元检测，同时适合于对大批量样品的筛查。

作为荧光标记探针的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒主要包含两种，一种是掺杂型，另外一种是共价型。由于掺杂型纳米颗粒主要是通过物理掺杂制备而成，其在应用过程中会存在荧光泄露的问题，而通过共价交联制备的共价型纳米颗粒避免了该问题的发生，但其制备时间较长，因此如何大大缩短荧光纳米颗粒的制备时间是亟需解决的问题。

中国专利CN201710012482.6公开了一种利用微波加热技术制备稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的方法，利用油包水(W/O)微乳分散体系制备表面带有羟基的SiO₂纳米颗粒，依次将氨基硅烷试剂、Eu³⁺的BHHCT络合物采用微波加热的方法对SiO₂进行表面修饰，形成具有荧光的稀土络合物，经丙酮封闭反应体系后，洗涤，即得产物共价型荧光稀土二氧化硅纳米颗粒。大大地缩短了反应时间，且荧光强度更高。

但上述专利所述的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒尚未进行生物标记的应用，本发明以上述专利所述的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒作为荧光探针，以醛基化葡聚糖作为交联剂，完成对卡那霉素单克隆抗体的荧光标记，实现了上述专利所述稀土荧光二氧化硅纳米颗粒生物应用检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题：针对现有技术存在的不足，以稀土荧光二氧化硅纳米颗粒为荧光探针，结合凝胶电泳成像与荧光免疫读卡仪，制备了一种特异性好、灵敏度高、快速简便、能定量检测卡那霉素残留的荧光免疫层析试纸条。

本发明的技术方案：