[发明专利]采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法

说明书

本发明公开了一种采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，涉及高效液相色谱分析法技术领域，采用以十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱，采用由作为A相的缓冲盐溶液或其与有机溶液的混合液和作为B相的有机溶液组成的流动相进行洗脱，采用紫外检测器作为检测器以测定利奥西呱原料药中的有关物质。本发明能够快速测得利奥西呱原料中有关物质的含量，特别适合于分离检测杂质ROCG‑三胺、ROCG‑甲酸甲酯和ROCG‑间氟的含量。

技术领域

本发明涉及高效液相色谱分析法技术领域，具体涉及一种采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法。

背景技术

利奥西呱，简称为ROCG，是由德国拜耳制药公司研发的能够激发可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的化合物，sGC通过作用于cGMP而调节多重血管床的血管舒张作用，可用于治疗心血管病证或/和性功能障碍。目前，拜耳制药公司研制的用于治疗肺动脉高压(PAH)的口服片剂已经获得FDA批准，商品名为Adempas。

在中国专利CN1330649C中公开了利奥西呱、其异构体和水合物的三种制备方法，其中一种制备方法中涉及到2-[1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺(以下简称为ROCG-三胺，专利文献中已经公开了此化合物的制备方法)和4,6-二氨基-2-[1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸甲酯(以下简称为ROCG-甲酸甲酯，专利文献中已经公开了此化合物的制备方法)等多个中间体。另外，利奥西呱原料药中还可能含有其异构体(以下简称为ROCG-间氟，可以参照专利文献中利奥西呱的制备方法获得)。以上所述的三个化合物为利奥西呱原料中较为常见的工艺杂质。

因此，为了控制利奥西呱原料药的质量，需要控制以上所述的三个工艺杂质以及其他杂质。在目前现有技术中，中国专利CN104374861B公开了一种用于检测利奥西呱化合物及其中间体纯度的方法。其中所述方法特征是采用UV检测器的高效液相色谱仪；色谱柱是Agilent RX C8,250mm×4.6mm，5μm；洗脱剂：A相是加入2ml磷酸溶液的浓度约为2g/L的辛烷磺酸钠水溶液：乙腈＝90:10，B相是乙腈；梯度程序：0min，27％的B相，20min，27％的B相，51min，65％的B相，52min，27％的B相；流速是1.0ml/min；柱温是40℃；检测波长是UV260nm。所述方法适合于对利奥西呱原料的质量监控。但该方法采用阴离子对试剂作为缓冲溶液，离子对试剂的浓度与对样品保留时间有直接影响，而且离子对试剂对pH值敏感，直接影响样品的重现性。另外，离子对试剂需长时间平衡系统，同时很难洗去，会大大缩短色谱柱使用寿命。

在现有的技术中，适合于分析检测利奥西呱原料药有关物质的分析方法具有严重缺陷。本发明提供一种适合于分离检测利奥西呱原料药有关物质的分析方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种专属性好，灵敏度高，准确度好，耐用性好、稳定性指示能力好的采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法。

本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：

采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，采用以十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱，采用由作为A相的缓冲盐溶液或其与有机溶液的混合液和作为B相的有机溶液组成的流动相进行洗脱，采用紫外检测器作为检测器以测定利奥西呱原料药中的有关物质；

所述流动相的洗脱采用梯度洗脱方式，至少包含三个阶段的梯度变化，其中第一阶段梯度变化是在0～20min内进行，A相在流动相中的体积含量为80～100％；第二阶段梯度变化是在第一阶段梯度变化的时间基础上于接下来的10～40min内进行，A相在流动相中的体积含量由80～100％变化至20～40％；第三阶段梯度变化是在第二阶段梯度变化的时间基础上于接下来的5～30min内进行，A相在流动相中的体积含量为20～40％，其中A相中有机溶剂的体积含量为0～20％；