[发明专利]一种利用暗场显微镜肉眼直接观察隐孢子虫的方法

说明书

技术领域

本发明属于病原体检测领域，具体涉及一种利用暗场显微镜肉眼直接观察隐孢子虫的方法。

背景技术

隐孢子虫(Cryptosporidium)是全球六大腹泻病原之一，属于人畜共患病原体，严重危害人类的公共卫生健康。在正常的人群中，感染隐孢子虫的病人表现为腹泻，并伴有胃痉挛、恶心、低烧、消化功能障碍等；对免疫力低下的人来说，病症多变且严重，多为持续性霍乱样腹泻，最终导致患者脱水死亡。隐孢子虫卵囊在环境中广泛存在，可通过水源和环境中的各种其它因素如动物接触、公共环境污染等进行传播造成疾病暴发。隐孢子虫被美国列为生物恐怖战剂中的寄生虫病原，也是世界多国饮用水质标准中规定的必检微生物病原之一。为了保障饮水安全和公共健康，隐孢子虫防控己经成为世界关注的研究热点。而检测隐孢子虫在环境中的分布对于隐孢子虫病防控至关重要。

目前，现有的检测隐孢子虫的方法主要包括：(1)美国环境保护署发布的饮用水中隐孢子虫卵囊的标准检测方法(EPA1623)，该方法的优点是在免疫磁珠分离的过程中去除了环境样本中的杂质，保证了提取出来的卵囊的纯度，灵敏性、准确性高，并可判断卵囊活性。但该方法工作量大、操作繁琐、所需的检测设备和耗材也非常昂贵，不适合于基层实验室大规模常规检测；(2)改良酸性染色法，其优点是步骤少、简便易行、结果明显、不需要复杂的仪器设备、适于实验室检测工作，但是该种方法假阳性检测率高；(3)ELISA法，其优点是简便、快速和敏感，但该方法也存在漏诊或误诊现象；(4)PCR检测，其优点是特异性和敏感性，短时间内扩增大量的目的片段，但该方法引物的设计非常重要，因为如果引物特异性不强，而且对DNA污染敏感，实验的重现性也不高，尤其是当感染剂量很小的时候，除此之外，PCR检测需要具有专业的实验技术和仪器，需要专业的技术人员，限制了其在基层工作中的使用。

本发明旨在提供一种利用暗场显微镜肉眼直接观察水中隐孢子虫的方法。首先将抗体和磁珠进行偶联，构建具有特异性捕获隐孢子虫的磁探针。此探针利用抗原抗体的特异性反应，可紧密结合隐孢子虫卵囊，该复合物在磁场的作用下做定向运动，从而达到分离孢子虫卵囊的作用，在暗场显微镜下可形成清晰为肉眼所见的金黄色花冠状结构。该分离检测技术在细菌、病毒和细胞的分离检测等方面应用较为广阔，但是直接利用暗场显微镜进行观察还未见报道。该方法能够对水样、乳制品和粪便中的隐孢子虫进行快速诊断和检测，缩短检测周期，简化检测过程，提高检测手段的普遍适用性，利于实地现场检测，从而快速、准确、敏感、简便地检测隐孢子虫的存在，及时防控，在很大程度上减少隐孢子虫对人类健康造成威胁。

发明内容

本发明旨在提供一种利用暗场显微镜肉眼直接观察隐孢子虫的方法，能够对水样、乳制品和粪便进行快速诊断和检测，缩短检测周期，简化检测过程，提高检测手段的普遍适用性，利于实地现场检测，从而快速、准确、敏感、简便地检测隐孢子虫的存在，及时防控，在很大程度上减少隐孢子虫对人类健康造成威胁。

为解决现有技术的不足，本发明目的是建立一种利用暗场显微镜肉眼直接观察隐孢子虫的方法，采用技术方案以下：

一种利用暗场显微镜肉眼直接观察隐孢子虫的方法，该方法是将商品化隐孢子虫卵囊抗体和商品化包被有蛋白A的磁珠进行新和偶联获得磁探针，然后利用装载有针对隐孢子虫卵囊抗体的磁探针对待测样品中的隐孢子虫进行捕获，然后在暗场显微镜观察结果。

本发明具体的步骤如下：

(1)磁珠的清洗：将包被有蛋白A的磁珠进行清洗，获得分散性较均一的磁珠；

(2)抗体的偶联：将隐孢子虫卵囊抗体和步骤(1)中清洗后的磁珠混合，进行新和偶联，获得具有特异捕获隐孢子虫能力的磁探针；

(3)将步骤(2)中磁探针与待测样本孵育一段时间，得混合液；

(4)磁分离上述混合液，用PBS重悬混合物后，滴加到载玻片上，暗场显微镜观察。

优选地，所述方法，步骤如下：

(1)磁珠的清洗：将包被有蛋白A的磁珠与含有BSA的PBS溶液进行混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于含有BSA的PBS溶液中，超声后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于含有BSA的PBS溶液中，获得分散性较均一的磁珠；

(2)抗体的偶联：将商品化隐孢子虫卵囊抗体和步骤(1)中清洗后的磁珠按照质量比为1:1-2:5混合，常温孵育1-6h；然后磁分离洗涤未结合抗体，最后用含BSA的PBS溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得具有特异捕获隐孢子虫的磁探针；