[发明专利]基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法

说明书

技术领域

本发明属于食品病害微生物检测领域，具体涉及一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是革兰氏阴性嗜盐细菌，隶属弧菌科中的弧菌属。它是近海的鱼类、虾类、蟹类、贝类等海产品中的重要的食源性致病菌之一，属人畜共患病菌，在水产品中的污染状况非常严重，是沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病原菌。为确保食品安全，保护人民身体健康，欧盟、美国等发达国家对水产品中的副溶血性弧菌做出了明确的规定，如欧盟规定副溶血性弧菌不得检出，而美国规定＜1×10⁴/g。我国已将该菌列为主要的检验或监测对象。目前，该菌是多数进出口水产品必检的致病菌之一。自2001年以来，副溶血性弧菌性食物中毒爆发已经成为中国最常见的食源性疾患，副溶血性弧菌性食物中毒的起数和人数一直处于第一位。

使用传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生长法及血清学鉴定虽然比较准确，但检测周期长、工作量大，繁琐费时。不仅如此，低水平的病原菌污染，食品加工后导致菌体的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素，使得传统的检测方法受到了一定的限制，因此，急需一些灵敏度更高、特异性更强、简便、快捷的水产品安全检测技术，以及时发现致病微生物，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。

科技创新产生了一系列新型的检测方法，如核酸分子扩增检测技术、免疫检测、生物传感等技术，为微生物、病毒的检测提供了新的手段，在食品安全检测中发挥了重要作用。免疫荧光技术(FAT)、酶联免疫吸附(ELISA)、分子检测技术(PCR、RFLP、AFLP、RAPD等)已经被用来检测各种水产病原。尽管目前已有多种微生物的检测方法，但大多需要较高的实验室条件，且操作复杂、耗时，只有熟练掌握了其操作技巧的人员才能完成测试，不适合在基层推广和使用，在发展中国家及我国临床条件有限的地区应用受到限制。

因此，有必要建立水产品中副溶血性弧菌经济、快速、准确、特异、灵敏、简便的检测诊断方法，提高医学卫生检验、疾病防控、水产品加工和进出口检验等部门的检测质量和效率。

核酸等温扩增技术(isothermal nucleic acid amplification technology)可在某一特定的温度下扩大特定DNA或RNA片段的拷贝数。与常规PCR技术相比，在遗传相关疾病和微生物检测中，核酸等温扩增技术可通过加热模块、水浴槽等简单非专业设备完成，对仪器要求大大简化，反应时间大幅缩短，因而更能满足现代分子检测技术“快速简便”的需求，具有非常大的实际应用价值。

目前利用纳米金探针作为特异DNA识别的研究层出不穷。纳米金因其高的比表面积、稳定的表面物理化学性质，特别适合作为分子识别反应的界面。将大量的识别分子固定在纳米金表面，可实现一系列的反应信号放大功能。此外，由于纳米金具有独特的等离子体共振光学性质，并随粒子形貌、表面修饰物、粒子间距、溶剂介电常数变化，表现为溶液颜色的显著改变，为实现基于纳米金探针的简便、灵敏、快速可视化分析提供了理论基础，使得构建一系列的溶液内纳米传感过程成为可能。

基于此，本发明将近年最新发展起来的新型的分子扩增反应(环介导等温扩增法)与具有优异的表面特性与光学性能的纳米材料(纳米金)结合起来，开发可现场快速检测副溶血性弧菌的检测方法。已有的等温分子扩增方法多依靠荧光比色检测手段，扩增时间较长，且多为有毒化学探针，本发明的方法实现了直接的可视化检测结果判定，并提高了对分子扩增反应的响应灵敏度，缩短了检测时间，摆脱了对荧光比色试剂以及荧光检测仪器的依赖性，可大幅降低检测成本，提高检测操作的安全性能。服务于水产品质量安全与疾病防控等领域，并为其他特定的病原微生物在食品质量安全与疾病防控检测手段提供技术参考。

发明内容

本发明的目的在于针对快速简便检测副溶血性弧菌的需求，提供了一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法。具体来说，是提供一种基于纳米金与等温核酸扩增反应检测副溶血性弧菌tlh基因的试剂及其制备方法，并提供基于该试剂在快速可视化检测中的应用方法。建立了水产品中副溶血性弧菌经济、快速、准确、特异、灵敏、简便的检测诊断方法，提高医学卫生检验、疾病防控、水产品加工和进出口检验等部门的检测质量和效率。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，所述方法包括如下步骤：

S1、制备链霉亲和素标记的纳米金；